ゼブラフィッシュ放射状グリア前駆細胞の非対称分裂におけるNotch/Δエンドサイトーシスを追跡するための抗体取り込みアッセイ
Summary
この研究では、ゼブラフィッシュの胚性脳の放射状グリア前駆細胞を分裂させる系統内Notch/DeltaDシグナル伝達をイメージングするための抗体取り込みアッセイを開発しています。
Abstract
運命の異なる2つの娘細胞を生成する非対称細胞分裂(ACD)は、細胞の多様性を生み出すための基本です。無脊椎動物と脊椎動物の両方の発達中の器官では、前駆細胞を非対称に分割すると、自己再生するNotchとNotchlo分化する娘が生成されます。ゼブラフィッシュの脳では、脊椎動物の主要な神経幹細胞である放射状グリア前駆細胞(RGP)が主にACDを受けて、1つのRGPニューロンと1つの分化ニューロンを産生します。ゼブラフィッシュ胚の光学的明瞭さと容易なアクセス性により、ACD中にNotchシグナル伝達の非対称性がいつどのように確立されるかを直接視覚化するためのin vivoタイムラプスイメージングに最適です。最近の研究では、NotchリガンドΔDの動的エンドサイトーシスがACD中の細胞運命決定に重要な役割を果たし、その過程は進化的に保存された極性調節因子Par-3(Pard3としても知られる)とダイニンモーター複合体によって制御されることが示されています。有糸分裂RGPにおけるNotchシグナル伝達エンドソームのin vivo輸送パターンを視覚化するために、この抗体取り込みアッセイを開発しました。このアッセイを用いて、RGP分裂中のDeltaD含有エンドソームの動態を明らかにしました。
Introduction
Notchシグナル伝達は、後生動物の発生中の細胞運命の決定とパターン形成を制御しており1、最近の研究では、幹細胞分裂におけるNotchシグナル伝達は主にエンドサイトーシス輸送に依存していることが示されています2,3。エンドサイトーシスNotch/Deltaは、核内のNotchシグナル伝達を活性化し、Notch標的遺伝子の転写を増強することができます4,5,6。指向性Notch/Δエンドソーム輸送は、ショウジョウバエ感覚器官前駆体(SOP)細胞の非対称細胞分裂(ACD)中に最初に観察され、pIIbよりもpIIaで高いNotchシグナル伝達活性をもたらしました7,8。抗デルタ抗体および抗Notch抗体を用いた抗体取り込みアッセイは、有糸分裂SOP細胞のエンドサイトーシスプロセスをモニターするために適用されています。Notch/DeltaDエンドソームは、細胞質分裂中にキネシンモータータンパク質とともに中央紡錘体に移動し、細胞分裂の最後の瞬間に非対称中央紡錘体の逆平行配列によりpIIa細胞に非対称に転座します3,8。これらの研究は、ショウジョウバエSOP細胞における不斉分裂を制御する分子機構に光を当てたが、脊椎動物の放射状グリア前駆細胞(RGP)において同様のエンドサイトーシス過程が起こるかどうかは不明である。
さらに、脊椎動物のRGP分裂中に不斉Notch/DeltaDシグナル伝達を制御する分子機構はよくわかっていません。ゼブラフィッシュでは、NotchとΔの相互作用がΔDリガンド9のエンドサイトーシスを促進することが報告されている。DeltaDエンドサイトーシスが、発達中の脊椎動物の脳における娘細胞の細胞運命の選択に影響を与えることができるかどうかは不明です。最近の研究では、蛍光標識抗DeltaD抗体を神経管に注入すると、神経上皮細胞においてサラエンドソーム特異的に標識することができ、サラエンドソームを含む抗ΔDは増殖中の娘細胞に優先的に分離することができることが示されている10。エンドソームからのNotchシグナル伝達が娘細胞の運命を調節できることが示唆されています。以前の結果は、発達中の前脳のほとんどのゼブラフィッシュRGP細胞がACDを受け、娘細胞の運命決定が系統内のNotch/DeltaDシグナル伝達に依存することを示しています11。ゼブラフィッシュRGPにおける系統内Notch/DeltaDシグナルの性質を解明するために、ゼブラフィッシュ発生中の脳における抗ΔD抗体取り込みアッセイを開発しました。このプロトコルを使用して、有糸分裂RGPにおけるDeltaDエンドサイトーシス輸送のライブラベリングとイメージングに成功しました。
蛍光標識された抗DeltaD抗体は、前脳室に沿ってRGPに効率的に取り込まれます。これは、非対称に分割されたRGPにおけるDeltaDエンドソームの方向性のあるトラフィックの発見を大いに促進しました12,13。ショウジョウバエの培養およびゼブラフィッシュ脊髄10用に開発された以前の抗体取り込みプロトコルと比較して、このプロトコルは、特に10 nL未満のマイクロインジェクション抗体混合物で、脳室細胞層で長期的かつ高効率の抗DeltaD標識を達成しました。後脳室注射は、ゼブラフィッシュ胚では後脳室が十分に拡張され、発生初期段階で脳脊髄液で満たされるため、発達中の脳に抗体取り込みアッセイを適用するのに非常に便利です14。重要な発達中の組織を傷つけることなく抗体混合物を後脳室に注入することにより、プロトコルは前脳のイメージングゾーンへの損傷の可能性を可能な限り最小限に抑えました。注入された一次抗体の投与量を減らすことで、in vivoでの内因性Δ-Notchシグナル伝達を妨害する潜在的な副作用も回避されました。このプロトコルは、他の薬理学的または遺伝的摂動と容易に組み合わせることができ、さまざまな発生段階で利用でき、成人の脳やヒト多能性幹細胞由来の2D/3D脳オルガノイドに適応できる可能性があります。まとめると、このプロトコルにより、ACD中にNotchシグナリングの非対称性がいつどのように確立されるかを理解することが可能になりました。このプロトコルの実装を成功させるための主な課題は、特定の実験条件に基づいて適切な濃度の抗体を正確に送達することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、ゼブラフィッシュ放射状グリア前駆細胞におけるエンドソームNotch/Delta輸送を高効率で標識およびイメージングするための抗体取り込みアッセイを開発しました。ショウジョウバエSOP細胞7,8で標識抗DeltaD抗体を追跡するために使用された以前の方法と比較して、私たちの方法は、結合抗体内のサンプルのインキュベーションの代わりにマイ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、NIH R01NS120218、UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation、およびChan Zuckerberg Biohubの支援を受けました。
Materials
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
Referências
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