प्रतिदीप्ति-सक्रिय न्यूक्लियस सॉर्टिंग का उपयोग करके वसा ऊतकों के साथ एडिपोसाइट्स-विशिष्ट एटीएसी-सेक
Summary
हम उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (एटीएसी-सेक) के साथ ट्रांसपोसेज-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, विशेष रूप से परमाणु फ्लोरेसेंस लेबलिंग के साथ ट्रांसजेनिक रिपोर्टर चूहों से अलग वसा ऊतकों के साथ न्यूक्लियस सॉर्टिंग का उपयोग करके एडिपोसाइट्स पर।
Abstract
उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (एटीएसी-सेक) के साथ ट्रांसपोसेज-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख एक मजबूत तकनीक है जो जीनोम-वाइड क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी प्रोफाइलिंग को सक्षम बनाती है। यह तकनीक जैविक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला में जीन अभिव्यक्ति के नियामक तंत्र को समझने के लिए उपयोगी रही है। यद्यपि एटीएसी-सेक को विभिन्न प्रकार के नमूनों के लिए संशोधित किया गया है, लेकिन वसा ऊतकों के लिए एटीएसी-सेक विधियों के प्रभावी संशोधन नहीं हुए हैं। वसा ऊतकों के साथ चुनौतियों में जटिल सेलुलर विषमता, बड़ी लिपिड सामग्री और उच्च माइटोकॉन्ड्रियल संदूषण शामिल हैं। इन समस्याओं को दूर करने के लिए, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो ट्रांसजेनिक रिपोर्टर न्यूक्लियर टैगिंग और ट्रांसलेटिंग राइबोसोम एफिनिटी प्यूरीफिकेशन (एनयूटीआरएपी) माउस से वसा ऊतकों के साथ प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक छंटाई को नियोजित करके एडिपोसाइट-विशिष्ट एटीएसी-सेक की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल न्यूक्लियस इनपुट और अभिकर्मकों की मात्रा को कम करते हुए न्यूनतम बर्बाद अनुक्रमण पढ़ने के साथ उच्च गुणवत्ता वाले डेटा का उत्पादन करता है। यह पेपर माउस वसा ऊतकों से अलग एडिपोसाइट नाभिक के उपयोग के लिए मान्य एटीएसी-सेक विधि के लिए विस्तृत चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल विभिन्न जैविक उत्तेजनाओं पर एडिपोसाइट्स में क्रोमैटिन गतिशीलता की जांच में सहायता करेगा, जो उपन्यास जैविक अंतर्दृष्टि की अनुमति देगा।
Introduction
वसा ऊतक, जो लिपिड अणुओं के रूप में अतिरिक्त ऊर्जा के भंडारण के लिए विशिष्ट है, चयापचय विनियमन के लिए एक महत्वपूर्ण अंग है। एडिपोसाइट्स गठन और रखरखाव का सख्त नियंत्रण वसा ऊतक समारोह और पूरे शरीर की ऊर्जा होमियोस्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण है। कई ट्रांसक्रिप्शनल नियामक एडिपोसाइट भेदभाव, प्लास्टिसिटी और फ़ंक्शन के नियंत्रण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं; इनमें से कुछ नियामकों को मनुष्यों में चयापचय संबंधी विकारों में फंसाया गया है 2,3. जीन अभिव्यक्ति और एपिजेनोमिक विश्लेषण के लिए उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तकनीकों में हालिया प्रगति ने एडिपोसाइट्स जीव विज्ञान 4 के आणविक नियामकों की खोज को और सुविधाजनक बनायाहै। इन ऊतकों की विविधता के कारण वसा ऊतकों का उपयोग करके आणविक प्रोफाइलिंग अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण है। वसा ऊतक में मुख्य रूप से एडिपोसाइट्स होते हैं, जो वसा भंडारण के लिए जिम्मेदार होते हैं, लेकिन इसमें विभिन्न अन्य सेल प्रकार भी होते हैं, जैसे फाइब्रोब्लास्ट, एंडोथेलियल कोशिकाएं और प्रतिरक्षा कोशिकाएं5. इसके अलावा, तापमान और पोषण संबंधी स्थिति जैसे पैथोफिजियोलॉजिकल परिवर्तनों के जवाब में वसा ऊतक की सेलुलर संरचना नाटकीय रूप से बदलजाती है। इन समस्याओं को दूर करने के लिए, हमने पहले एक ट्रांसजेनिक रिपोर्टर माउस विकसित किया था, जिसका नाम न्यूक्लियर टैगिंग एंड ट्रांसलेटिंग राइबोसोम एफिनिटी प्यूरीफिकेशन (न्यूटीआरएपी) था, जो जीएफपी-टैग किए गए राइबोसोम और एमचेरी-टैग किए गए बायोटिनिलेटेड नाभिक का उत्पादन करताहै। दोहरी लेबलिंग प्रणाली ऊतकों के साथ सेल प्रकार-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्टोमिक और एपिजेनोमिक विश्लेषण करने में सक्षम बनाती है। एडिपोसाइट्स-विशिष्ट एडिपोनेक्टिन-क्रे लाइनों (एडिपोक-न्यूट्रैप) के साथ पार किए गए न्यूट्रैप चूहों का उपयोग करते हुए, हमने पहले विवो में शुद्ध एडिपोसाइट आबादी से जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल और क्रोमैटिन राज्यों की विशेषता बताई और निर्धारित किया कि मोटापे के दौरान वे कैसे बदल जाते हैं 7,8. इससे पहले, एनयूटीआरएपी चूहों को भूरे और बेज एडिपोसाइट्स-विशिष्ट यूसीपी 1-क्रे लाइनों (यूसीपी 1-न्यूट्रैप) के साथ पार किया गया था, जिससे हमें तापमान परिवर्तनके जवाब में दुर्लभ थर्मोजेनिक एडिपोसाइट्स आबादी, बेज एडिपोसाइट्स के एपिजेनोमिक रीमॉडेलिंग को चिह्नित करने की अनुमति मिली।
एटीएसी-सेक जीनोम-वाइड क्रोमैटिन पहुंच का आकलन करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विश्लेषणात्मक विधि है। एटीएसी-सेक में उपयोग किया जाने वाला हाइपर-रिएक्टिव टीएन 5 ट्रांसपोसेस नाभिक 10 के क्रोमैटिन-सुलभ क्षेत्र में अनुक्रमण एडाप्टर को टैग करके खुले क्रोमैटिन क्षेत्रों की पहचान करने की अनुमतिदेता है। एटीएसी-सेक एक सरल विधि है, फिर भी यह मजबूत परिणाम प्रदान करता है और कम इनपुट नमूनों के साथ भी अत्यधिक कुशल है। इस प्रकार, यह सबसे लोकप्रिय एपिजेनोमिक प्रोफाइलिंग विधियों में से एक बन गया है और विभिन्न जैविक संदर्भों के भीतर जीन अभिव्यक्ति के नियामक तंत्र की समझ में योगदान दिया है। चूंकि मूल एटीएसी-सेक प्रोटोकॉल बनाया गया था, इसलिए विभिन्न प्रकार के नमूनों के लिए प्रोटोकॉल को संशोधित और अनुकूलित करने के लिए विभिन्न एटीएसी-सेक-व्युत्पन्न तकनीकों को आगे विकसित किया गया है। उदाहरण के लिए, फास्ट-एटीएसी को रक्त कोशिका के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है11, ओमनी-एटीएसी जमे हुए ऊतक नमूने12 के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है, और मिनीएटीएसी-सेक प्रारंभिक चरण भ्रूण विश्लेषण13 के लिए प्रभावी है। हालांकि, एडिपोसाइट्स के लिए एटीएसी-सेक विधि को लागू करना, विशेष रूप से ऊतक के नमूनों से, अभी भी चुनौतीपूर्ण है। वसा ऊतक की विविधता के अलावा, इसकी उच्च लिपिड सामग्री नाभिक अलगाव के बाद भी टीएन 5 ट्रांसपोसेस द्वारा कुशल पुनर्संयोजन प्रतिक्रियाओं में हस्तक्षेप कर सकती है। इसके अलावा, एडिपोसाइट्स में उच्च माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री, विशेष रूप से भूरे और बेज एडिपोसाइट्स में, उच्च माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए संदूषण और बर्बाद अनुक्रमण का कारण बनती है। यह पेपर एडिपोक-न्यूट्रैप चूहों (चित्रा 1) का उपयोग करके एडिपोसाइट-विशिष्ट एटीएसी-सेक के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। प्रतिदीप्ति-लेबल न्यूक्लियस सॉर्टिंग का लाभ उठाकर, यह प्रोटोकॉल अन्य भ्रामक सेल प्रकारों से दूर एडिपोसाइट नाभिक की शुद्ध आबादी के संग्रह और लिपिड, माइटोकॉन्ड्रिया और ऊतक मलबे के कुशल निष्कासन की अनुमति देता है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल सेल प्रकार-विशिष्ट उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उत्पन्न कर सकता है और मानक प्रोटोकॉल की तुलना में इनपुट और अभिकर्मकों की कम मात्रा का उपयोग करते हुए माइटोकॉन्ड्रियल रीड से अपशिष्ट को कम कर सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पेपर में, हमने विवो में एडिपोसाइट्स-विशिष्ट क्रोमैटिन पहुंच का आकलन करने के लिए एक अनुकूलित एटीएसी-सेक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। एडिपोक-न्यूट्रैप माउस का उपयोग करके इस एटीएसी-सेक प्रोटोकॉल न…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को IUSM शोआल्टर रिसर्च ट्रस्ट फंड (H.C.R.), मधुमेह और मेटाबोलिक रोग पायलट और व्यवहार्यता अनुदान (H.C.R.), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज (R01DK129289 से H.C.R.), और अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन जूनियर फैकल्टी अवार्ड (7-21-JDF-056 से H.C.R.) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio 5 |
Referências
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