Адипоцит-специфический ATAC-Seq с жировыми тканями с использованием флуоресцентно-активированной сортировки ядер
Summary
Мы представляем протокол анализа транспозаз-доступного хроматина с высокопроизводительным секвенированием (ATAC-seq), в частности, на адипоцитах с использованием сортировки ядер с жировыми тканями, выделенными от трансгенных репортерных мышей с ядерной флуоресцентной маркировкой.
Abstract
Анализ на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным секвенированием (ATAC-seq) — это надежный метод, который позволяет профилировать доступность хроматина в масштабах всего генома. Этот метод был полезен для понимания регуляторных механизмов экспрессии генов в ряде биологических процессов. Несмотря на то, что ATAC-seq был модифицирован для различных типов образцов, эффективных модификаций методов ATAC-seq для жировых тканей не было. Проблемы с жировыми тканями включают сложную клеточную гетерогенность, большое содержание липидов и высокое загрязнение митохондрий. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали протокол, который позволяет адипоцит-специфическому ATAC-seq с использованием флуоресцентно-активированной сортировки ядра жировыми тканями трансгенной репортерной мыши Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Этот протокол позволяет получать высококачественные данные с минимальными потерями при чтении секвенирования при одновременном уменьшении количества входных данных ядра и реагентов. В этой статье приведены подробные пошаговые инструкции по методу ATAC-seq, валидированному для использования ядер адипоцитов, выделенных из жировых тканей мышей. Этот протокол поможет в исследовании динамики хроматина в адипоцитах при различных биологических стимуляциях, что позволит получить новые биологические идеи.
Introduction
Жировая ткань, которая специализируется на хранении избыточной энергии в виде липидных молекул, является ключевым органом для регуляции обмена веществ. Строгий контроль образования и поддержания адипоцитов жизненно важен для функции жировой ткани и энергетического гомеостаза всего организма1. Многие транскрипционные регуляторы играют решающую роль в контроле дифференцировки, пластичности и функции адипоцитов; Некоторые из этих регуляторов участвуют в метаболических нарушениях у людей 2,3. Последние достижения в области высокопроизводительных методов секвенирования экспрессии генов и эпигеномного анализа еще больше облегчили открытие молекулярных регуляторов биологии адипоцитов4. Исследования молекулярного профилирования с использованием жировых тканей сложно проводить из-за гетерогенности этих тканей. Жировая ткань состоит в основном из адипоцитов, которые отвечают за накопление жира, но также содержит различные другие типы клеток, такие как фибробласты, эндотелиальные клетки и иммунные клетки5. Кроме того, клеточный состав жировой ткани резко изменяется в ответ на патофизиологические изменения, такие как температура и состояние питания6. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы ранее разработали трансгенную мышь-репортер, названную Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), которая продуцирует RFP-меченные GFP рибосомы и биотинилированные ядра, меченные mCherry, Cre-рекомбиназ-зависимым образом7. Система двойного мечения позволяет проводить специфический для типа клеток транскриптомный и эпигеномный анализ тканей. Используя мышей NuTRAP, скрещенных с адипоцит-специфическими линиями адипонектина-Cre (Adipoq-NuTRAP), мы ранее охарактеризовали профили экспрессии генов и состояния хроматина из чистых популяций адипоцитов in vivo и определили, как они изменяются при ожирении 7,8. Ранее скрещивание мышей NuTRAP с коричневыми и бежевыми адипоцитарно-специфическими линиями Ucp1-Cre (Ucp1-NuTRAP) позволило охарактеризовать эпигеномное ремоделирование редкой термогенной популяции адипоцитов, бежевых адипоцитов, в ответ на изменения температуры9.
ATAC-seq является широко используемым аналитическим методом для оценки доступности хроматина в масштабах всего генома. Гиперреактивная транспозаза Tn5, используемая в ATAC-seq, позволяет идентифицировать открытые области хроматина путем маркировки адаптеров секвенирования в доступной для хроматина области ядер10. ATAC-seq — это простой метод, но он обеспечивает надежные результаты и высокую эффективность даже при использовании образцов с низким вводом. Таким образом, он стал одним из самых популярных методов эпигеномного профилирования и способствовал пониманию регуляторных механизмов экспрессии генов в различных биологических контекстах. С тех пор, как был создан оригинальный протокол ATAC-seq, были доработаны различные методы, производные от ATAC-seq, для модификации и оптимизации протокола для различных типов образцов. Например, Fast-ATAC предназначен для анализа образцовклеток крови 11, Omni-ATAC является оптимизированным протоколом для замороженных образцовтканей 12, а MiniATAC-seq эффективен для анализа эмбрионов на ранних стадиях13. Тем не менее, применение метода ATAC-seq к адипоцитам, особенно из образцов тканей, по-прежнему является сложной задачей. В дополнение к гетерогенности жировой ткани, ее высокое содержание липидов может мешать эффективным рекомбинационным реакциям транспозазы Tn5 даже после выделения ядра. Кроме того, высокое содержание митохондрий в адипоцитах, особенно в коричневых и бежевых адипоцитах, вызывает высокое загрязнение митохондриальной ДНК и нерациональное чтение секвенирования. В этой статье описывается протокол для специфического для адипоцитов ATAC-seq с использованием мышей Adipoq-NuTRAP (рис. 1). Используя преимущества сортировки ядер, меченных флуоресценцией, этот протокол позволяет собирать чистые популяции ядер адипоцитов вдали от других смешанных типов клеток и эффективно удалять липиды, митохондрии и тканевый мусор. Следовательно, этот протокол может генерировать высококачественные данные для конкретных типов клеток и минимизировать отходы от митохондриальных считываний, используя при этом меньшее количество входных данных и реагентов по сравнению со стандартным протоколом.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы представили оптимизированный протокол ATAC-seq для оценки доступности специфического хроматина для адипоцитов in vivo. Этот протокол ATAC-seq с использованием мыши Adipoq-NuTRAP успешно сгенерировал профили доступности хроматина, специфичные для адипоцитов. Наиболее важным фак?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Исследовательским целевым фондом IUSM Showalter (H.C.R.), пилотным и технико-экономическим грантом Центра диабета и метаболических заболеваний IUSM (H.C.R.), Национальным институтом диабета, болезней органов пищеварения и почек (R01DK129289 для H.C.R.) и премией младших преподавателей Американской диабетической ассоциации (7-21-JDF-056 для H.C.R.).
Materials
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio 5 |
Referências
- Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
- Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507 (2019).
- Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
- Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
- Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).
- Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
- Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).
- Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).
- Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin’s hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).
