Denne protokol beskriver, hvordan man etablerer, vedligeholder, genetisk modificerer, differentierer, funktionelt karakteriserer og transplanterer lacrimalkirtelorganoider afledt af primært muse- og humant væv.
Lacrimalkirtlen er et vigtigt organ for okulær overfladehomeostase. Ved at producere den vandige del af tårefilmen beskytter den øjet mod udtørringsstress og eksterne fornærmelser. Lidt er kendt om lacrimal kirtel (pato) fysiologi på grund af manglen på tilstrækkelige in vitro modeller. Organoidteknologi har vist sig som en nyttig eksperimentel platform for flere organer. Her deler vi en protokol til etablering og vedligeholdelse af mus- og humane lacrimalkirtelorganoider startende fra lacrimalkirtelbiopsier. Ved at ændre dyrkningsbetingelserne forbedrer vi lacrimalkirtelorganoidfunktionaliteten. Organoid funktionalitet kan undersøges gennem en “grædende” assay, som indebærer at udsætte lacrimalkirtelorganoiderne for udvalgte neurotransmittere for at udløse tårefrigivelse i deres lumen. Vi forklarer, hvordan man afbilder og kvantificerer dette fænomen. For at undersøge rollen af gener af interesse i lacrimalkirtelhomeostase, kan disse genetisk modificeres. Vi beskriver grundigt, hvordan man genetisk modificerer lacrimalkirtelorganoider ved hjælp af baseeditorer – fra guide RNA-design til organoid klongenotypning. Endelig viser vi, hvordan man undersøger det regenerative potentiale af humane lacrimalkirtelorganoider ved ortopisk implantation i musen. Sammen giver dette omfattende værktøjssæt ressourcer til at bruge mus- og humane lacrimalkirtelorganoider til at studere lacrimalkirtel (pato)fysiologi.
Lacrimalkirtlen er kirtelepitelet, der er ansvarlig for at producere det meste af det vandige lag af tårefilmen1. Det vandige lag af tårefilmen indeholder ikke kun vand til smøring af den okulære overflade, men også et stort repertoire af antimikrobielle komponenter, der beskytter den okulære overflade mod infektioner2. Når lacrimalkirtlen er beskadiget eller betændt, opstår tørre øjne, hvilket resulterer i ubehag for patienterne og i sidste ende kan føre til tab af syn3. I årenes løb har modelsystemer til undersøgelse af lacrimalkirtlen, især den menneskelige kirtel, været begrænset 4,5,6. Dette har bidraget til et videnshul vedrørende tårekirtelfunktion under fysiologiske og patologiske tilstande.
For nylig er der udviklet in vitro-modeller til at studere lacrimalkirtlen i en skål 7,8,9. Disse lacrimalkirtelorganoider stammer fra voksne stamceller dyrket som tredimensionelle strukturer i en ekstracellulær matrix suppleret med en cocktail af vækstfaktorer, der opretholder deres regenerative kapacitet in vitro7. Fordelen ved voksne stamceller (ASC) afledte organoider er, at de kan opretholdes i meget lang tid, mens de rekapitulerer sunde vævsfunktioner. Denne type organoid består udelukkende af epitelceller, i modsætning til inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte organoider, som også kan indeholde stromale celler, for eksempel. I modsætning til pluripotente stamcelleorganoider (PSC) er ASC-organoider etableret direkte fra voksent væv og kræver ingen genetiske modifikationer, der skal udvides. ASC-organoider udtrykker voksne egenskaber10.
Denne protokol indeholder en værktøjskasse til at udlede lacrimalkirtelorganoider fra mus og humant primærvæv. Protokollen beskriver, hvordan man yderligere forbedrer organoidernes funktionalitet ved simpel vækstfaktortilbagetrækning, og hvordan man provokerer organoiderne til at udskille tårevæske ved at udføre et hævelsesassay. Denne protokol inkluderer desuden en elektroporationsbaseret transfektionsmetode til genetisk manipulation af museorganoider ved hjælp af CRISPR-afledte baseredaktører. I modsætning til konventionel Cas9 tillader brugen af baseeditorer modifikation af enkeltbaser i genomet uden at generere et dobbeltstrenget brud11,12. Endelig beskrives den ortotopiske transplantation af humane lacrimalkirtelorganoider til immundefekte mus og den efterfølgende histologiske vurdering af engraftmentet. Denne lacrimal kirtel organoid værktøjssæt kan bruges i forskning på lacrimal kirtel regenerering og funktion og til genetisk og inflammatorisk sygdom modellering.
Denne protokol beskriver etablering og anvendelse af lacrimalkirtelorganoider til funktionelle assays, mutationsmodellering og transplantation. Ved etablering af mus- og humane lacrimalkirtelorganoider er vævsdissociation afgørende. Hvis vævet ikke fordøjes tilstrækkeligt, vil organoidudbyttet være lavt. Hvis vævet er overfordøjet, vil cellerne dø og ikke vokse ud som organoider. Hvert væv skal fordøjes med et specifikt enzym i et bestemt tidsrum for at sikre optimal organoid udvækst14,17,18. Lacrimalkirtlen er et ret blødt væv, hvor en kollagenasefordøjelse på 5-10 min kombineret med pipetteringsbaseret mekanisk dissociation er tilstrækkelig til at isolere små stykker væv. Hvis enkeltceller skal opnås til applikationer såsom enkeltcelle RNA-sekventering, kan dissociationen udføres i længere tid, indtil enkeltcellestadiet er nået, men dissociation bør stoppes, så snart enkeltceller opnås for at begrænse ethvert fald i levedygtigheden. Da vævsdissociation er så afgørende, er overfordøjelse den mest sandsynlige årsag til svigt i lacrimalkirtelorganoidetablering.
Den passende vedligeholdelse af lacrimalkirtelorganoider er vigtig for deres anvendelse. Langsigtet vedligeholdelse er et kendetegn ved voksne stamcelleafledte lacrimalkirtelorganoider sammenlignet med inducerede pluripotente stamcelleafledte organoider 7,17. For at opnå langvarig vedligeholdelse skal der udføres regelmæssig organoidopdeling og mediumændringer. Uden dette begynder organoider at differentiere og udvikle nedsat stamcellepotentiale, hvilket hæmmer deres langsigtede vedligeholdelse7. På dette trin igen kan overfordøjelse dræbe stamcellerne og forringe organoid vedligeholdelse. Til regelmæssig vedligeholdelse er organoid dissociation i enkeltceller ikke påkrævet. For at generere klonale knock-out organoide linjer er det imidlertid afgørende at begynde med enkeltceller. Hvis ikke, vil organoiderne bestå af en mosaik af celler med forskellige genetiske baggrunde, hvilket gør det umuligt at analysere effekten af en enkelt, defineret mutation. Her beskriver vi brugen af en C- > T-baseeditor til at generere stopkodoner. Denne genomeditor er afhængig af tilstedeværelsen af arginin-, glutamin- eller tryptophankodoner inden for 12-18 baser fra en NGG PAM. Når disse betingelser ikke er opfyldt ved design af et gRNA, kan konventionelle Cas9- eller C->-baseeditorer med alternative PAM’er anvendes 7,18. Imidlertid introducerer konventionel Cas9 dobbeltstrengede brud, der resulterer i indels ved reparation11. Da begge alleler kan have forskellige indels, kræver klongenotypning yderligere forsigtighed. Dekonvolution af de indførte modifikationer bør udføres for at sikre, at begge alleler indeholder indels uden for rammen, og dermed at organoidkloner slås ud for det gen, der er målrettet19. Fordelen ved C- > T-baseeditorer ligger i, at de kan bruges til at modellere punktmutationer, der ikke nødvendigvis resulterer i stopkodoner. For eksempel kan de bruges til at modellere specifikke Pax6-mutationer, der findes hos patienter med aniridi for at studere deres indvirkning på lacrimalkirtelfysiologi20.
Lacrimalkirtlen udskiller den vandige del af tårefilmen1. Tåresekretion kan rekapituleres i humane organoider efter differentiering medieret af vækstfaktortilbagetrækning og NOTCH-hæmning. Under disse forhold gennemgår organoider terminal differentiering og kan ikke opretholdes yderligere. Alligevel kan differentierede lacrimalkirtelorganoider styre udviklingen af tårefremkaldende lægemidler i forbindelse med tørre øjne, potentielt i skærme med høj kapacitet. Riveanalysen præsenteret i denne protokol er den, der i øjeblikket giver den største ændring i organoidstørrelse på kort tid, hvilket gør det lettere at kvantificere i forbindelse med en lægemiddelskærm 7,9,17.
Stamcelleterapi har et stort løfte om regenerering af tårekirtlen ved tørre øjne21. Voksne stamcelleafledte lacrimalkirtelorganoider kan være et kildemateriale til sådanne anvendelser. Protokollen, der præsenteres her, resulterer i human lacrimalkirtelorganoid engraftment, hovedsagelig som cyster. Lav organoid engraftment kan opstå på grund af organoider, der injiceres på det forkerte sted. Træning af injektionsproceduren med et farvestof gør det muligt at spore injektionsstedet og forbedrer i sidste ende injektionsnøjagtigheden. Alternativt kan museepidermis skæres for at have direkte adgang til lacrimalkirtlen, som det gøres hos rotter før22. Denne metode tager længere tid, men kan være mere nøjagtig. På den anden side integrerede organoiderne med den nuværende protokol ikke funktionelt i musens lacrimalkirtel. Lignende resultater er blevet observeret for iPSC-afledt lacrimalkirtelindkapsling22. Transplantationsmetoden kan forbedres yderligere ved at såre tårekirtlen på forhånd, bruge en musemodel med tørre øjne og/eller injicere organoiderne som enkeltceller eller små klumper. Ikke desto mindre kan voksne stamcelleafledte lacrimalkirtelorganoider og det relaterede værktøjssæt danne grundlag for fremtidige anvendelser inden for lacrimalkirtelforskning og regenerativ medicin.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Yorick Post for den indledende udvikling af protokollen. Dette arbejde blev delvist støttet af en pris fra Cancer Research UK Grand Challenge (C6307/A29058) og Mark Foundation for Cancer Research til SPECIFICANCER-teamet.
1.5 mL safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB) | Sigma-Aldrich | D5637 | CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 °C |
5x green GoTaq Flexi buffer | Promega | M891A | Store at -20 °C |
A83-01 | Tocris | 2939 | Store at -20 °C, stock at 30 mM, 10000x |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | store at 4 °C |
Agar plates containing Ampicillin | Hubrecht Institute | ||
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
Autoclave VAPOUR-Line lite | VWR chemicals | ||
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | Store at -20 °C, 50x |
BD Micro-Fine insulin needle 1 mL | BD Bioscience | 324825 | |
Benchtop microscope DMI1 | Leica | ||
Bovine serum albumine (BSA) | MP biomedicals | 160069 | Store at 4 °C |
BTXpress | BTX | MDS450805 | |
C57BL/6 mice | Hubrecht Institute | ||
Cassettes | Klinipath | 410-02S | |
CellBanker 1 | amsbio | 11910 | Cryopreservation medium, adhere to instructions |
Centrifuge | Eppendorf | ||
Citric acid monohydrate | J.T. Baker | 0088 | CAS: 5949-29-1 |
Collagenase I | Sigma Aldrich | C9407 | Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 °C |
Conical tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
Conical tubes 50 mL | Corning | CLS430828-500EA | |
Coverslips 24 mm x 50 mm | Menzel-Gläzer | BB024050S1 | |
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 – extracellular matrix | R&D Systems, Bio-Techne | 3533-001-02 | Store at -20 °C, keep at 4 °C for up to 1 month |
DAPT | Sigma Aldrich | D5942 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x |
Disodium hydrogen phosphate anhydrous | VWR chemicals | 28026.292 | CAS: 7558-79-4 |
Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | CAS:10028-24-7 |
Dispase | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | Aliquots at 50 U/mL, store at -20 °C until use, 400x |
Disposable Scalpel Sterile N° 10 | Swann Morton | 3033838 | |
DM4000 microscope | Leica | ||
dNTPs 25 mM | Promega | U1420 | Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 °C |
Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
Easy strainers 70 µm | Greiner | 542170 | |
Electroporation cuvette | Nepagene | EC002S | |
EnVision+/HRP mouse | Agilent | K400111-2 | |
Ethanol 100% | BOOM | 84045206;5000 | CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions |
Ethanol 70% | BOOM | 84010059.5000 | CAUTION |
Ethanol 96% | BOOM | 84050065.5000 | CAUTION |
EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | Live-imaging brightfield microscrope | |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Store at -20 °C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x |
Fiji | NIH, Fiji developers | ||
Formaldehyde solution 4% | Sigma-Aldrich | 1.00496 | CAS: 50-00-0, CAUTION |
Forskolin | Tocris | 1099 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100x |
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7805 | Store at -20 °C |
Haematoxylin | VWR chemicals | 10047105 | Store at room temperature |
HEPES | Gibco | 15630-080 | Store at 4 °C, 100x |
Histocore H and C, Tissue embedding machine | Leica | ||
Hot plate | Meidax | ||
Human nucleolar antigen antibody | Abcam | ab-190710 | |
Hydrochloric acid 5 N | ThermoFisher Scientific | 10605882 | CAS: 7647-01-0, CAUTION |
Hydrogen peroxyde 30% | Chem-lab | CL00.2308.1000 | CAS: 7722-84-1, CAUTION |
Hygromycin B-gold | InvivoGen | ant-hg | Stock at 100 mg/µL, 1000x |
Hygromycin resistance cassette-containing plasmid | Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156 | ||
IsoFlo 100% | Mecan | 5960501 | |
LB medium | Hubrecht Institute | ||
MgCl2 25 mM | Promega | A351H | Store at -20 °C |
Microtome RM2235 | Leica | ||
Midiprep DNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | K210005 | |
Miniprep DNA isolation kit | ThermoFisher scientific | K210003 | |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Store at -20 °C, stock at 500 mM, 400x |
NEPA21 electroporator | Nepagene | ||
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Store at -20 °C, stock at 1M, 100x |
NOD Scid Gamma (NSG) mice | Hubrecht Institute colony | ||
Noggin conditioned medium | U-Protein Express | Custom order | Store at -20 °C |
Noradrenaline | Sigma Aldrich | A7257 | Store at -20 °C, stock at 100 mM |
Oven | Memmert | Set at 58 °C | |
P20, P200 and P1000 pipettes | Gilson | ||
Paraffin | VWR chemicals | 10048502 | |
Pasteur pipettes, glass plugged | ThermoFisher Scientific | 1150-6973 | |
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG | IDT | ||
Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC | IDT | ||
pCMV_ABEmax_P2A_GFP | Addgene | 112101 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Store at -20 °C |
Pertex | Klinipath | AM-08010 | |
pFYF1320 | Addgene | 47511 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1000X, store at -20 °C |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x |
Petri dish, 10 cm | Greiner | 633102 | |
Q5 buffer | New England Biolabs | B9027S | |
Q5 high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | Store aliquots at -20 °C |
R-spondin 3 conditioned medium | U-Protein Express | Custom order | Store at -20 °C |
sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG | IDT | ||
Slides | StarFrost | MBB-0302-55A | Adhesive, ground |
Sodium azide | Merck | 8.22335.1000 | CAS: 26628-22-8, CAUTION |
Sodium cytrate dihydrate | J.T. Baker | 0280 | CAS: 6132-04-3 |
Standard Forward Primer: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC |
IDT | ||
Subcloning efficiency competent cells DH5alpha | Invitrogen | 18265-017 | |
Suspension cell culture plates (24-well) | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
Suspension cell culture plates (12-well) | Greiner Bio-One | 665102 | 12-well |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
TAE buffer | ThermoFisher Scientific | B49 | Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water |
Transposase-containing plasmid | Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156 | ||
TrypLE Express Enzyme | Invitrogen | 12605-028 | store at 4 °C |
U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT | IDT | ||
UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550 | |
Water bath | Tulabo | ||
Xylene | Klinipath | 4055-9005 | CAS: 1330-20-7, CAUTION |
Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x |