Denne protokollen beskriver hvordan man etablerer, vedlikeholder, genetisk modifiserer, differensierer, funksjonelt karakteriserer og transplanterer lacrimal kjertelorganoider avledet fra primærmus og humant vev.
Lakrimalkjertelen er et viktig organ for okulær overflatehomeostase. Ved å produsere den vandige delen av tårefilmen, beskytter den øyet mot uttørkingsstress og eksterne fornærmelser. Lite er kjent om tårekjertelen (pato)fysiologi på grunn av mangel på tilstrekkelige in vitro-modeller . Organoidteknologi har vist seg som en nyttig eksperimentell plattform for flere organer. Her deler vi en protokoll for å etablere og vedlikeholde mus og humane lacrimal kjertelorganoider som starter fra lacrimal kjertelbiopsier. Ved å endre kulturforholdene, forbedrer vi lacrimal kjertelorganoid funksjonalitet. Organoid funksjonalitet kan undersøkes gjennom en “gråtende” analyse, som innebærer å utsette lacrimal kjertelorganoider til utvalgte nevrotransmittere for å utløse tårefrigjøring i lumen. Vi forklarer hvordan vi kan avbilde og kvantifisere dette fenomenet. For å undersøke rollen som gener av interesse i lacrimal kjertel homeostase, kan disse bli genetisk modifisert. Vi beskriver grundig hvordan man genetisk modifiserer lacrimal kjertelorganoider ved hjelp av base redaktører – fra guide RNA design til organoid klon genotyping. Til slutt viser vi hvordan man kan undersøke det regenerative potensialet til humane lacrimal kjertelorganoider ved ortotopisk implantasjon i musen. Sammen gir dette omfattende verktøysettet ressurser til å bruke mus og humane lacrimal kjertelorganoider for å studere lacrimal kjertel (pato) fysiologi.
Lakrimalkjertelen er kjertelepitelet som er ansvarlig for å produsere det meste av det vandige laget av tårfilmen1. Det vandige laget av tårefilmen inneholder ikke bare vann for å smøre den okulære overflaten, men også et stort repertoar av antimikrobielle komponenter som beskytter den okulære overflaten mot infeksjoner2. Når lacrimal kjertelen er skadet eller betent, oppstår tørr øyesykdom, noe som resulterer i ubehag for pasienter og kan til slutt føre til tap av syn3. Gjennom årene har modellsystemer for å studere tårekjertelen, spesielt den menneskelige kjertelen, vært begrenset 4,5,6. Dette har bidratt til et kunnskapshull om tårekjertelfunksjon under fysiologiske og patologiske forhold.
Nylig har in vitro-modeller blitt utviklet for å studere lacrimal kjertelen i en tallerken 7,8,9. Disse lacrimal kjertelorganoider er avledet fra voksne stamceller dyrket som tredimensjonale strukturer i en ekstracellulær matrise supplert med en cocktail av vekstfaktorer som opprettholder deres regenerative kapasiteter in vitro7. Fordelen med voksne stamcelle (ASC) -avledede organoider er at de kan opprettholdes i svært lang tid mens de rekapitulerer sunne vevsfunksjoner. Denne typen organoid består utelukkende av epitelceller, i motsetning til induserte pluripotente stamceller (iPSC) -avledede organoider, som også kan inneholde stromale celler, for eksempel. I motsetning til pluripotente stamceller (PSC)-avledede organoider, etableres ASC-organoider direkte fra voksent vev og krever ingen genetiske modifikasjoner for å bli utvidet. ASC-organoider uttrykker voksne egenskaper10.
Denne protokollen inneholder en verktøykasse for å utlede lacrimal kjertelorganoider fra mus og humant primærvev. Protokollen beskriver hvordan man ytterligere kan forbedre organoidenes funksjonalitet ved enkel tilbaketrekking av vekstfaktor og hvordan man provoserer organoidene til å utskille tårevæske ved å utføre en hevelsesanalyse. Denne protokollen inkluderer i tillegg en elektroporasjonsbasert transfeksjonsmetode for genetisk manipulering av museorganoider ved hjelp av CRISPR-avledede baseredigerere. I motsetning til konvensjonell Cas9 tillater bruk av baseredigerere modifisering av enkeltbaser i genomet uten å generere et dobbeltstrenget brudd11,12. Til slutt beskrives ortotopisk transplantasjon av humane tårekjertelorganoider til immundefekte mus og den påfølgende histologiske vurderingen av transplantasjonen. Dette lacrimal kjertel organoid verktøykasse kan brukes i forskning på lacrimal kjertel regenerering og funksjon og for genetisk og inflammatorisk sykdom modellering.
Denne protokollen beskriver etablering og bruk av lacrimal kjertelorganoider for funksjonelle analyser, mutasjonsmodellering og transplantasjon. Når du etablerer mus og humane lacrimal kjertelorganoider, er vevsdissosiasjon avgjørende. Hvis vevet ikke er tilstrekkelig fordøyd, vil organoidutbyttet være lavt. Hvis vevet er overfordøyd, vil cellene dø og ikke vokse ut som organoider. Hvert vev skal fordøyes med et spesifikt enzym i en bestemt tid for å sikre optimal organoid utvekst14,17,18. Lakrimalkjertelen er et ganske mykt vev for hvilket en kollagenasefordøyelse på 5-10 minutter kombinert med pipetteringsbasert mekanisk dissosiasjon er tilstrekkelig til å isolere små biter av vev. Hvis enkeltceller må oppnås for applikasjoner som enkeltcelle RNA-sekvensering, kan dissosiasjonen utføres lenger til enkeltcellestadiet er nådd, men dissosiasjon bør stoppes så snart enkeltceller er oppnådd for å begrense enhver reduksjon i levedyktighet. Siden vevsdissosiasjon er så avgjørende, er overfordøyelse den mest sannsynlige årsaken til svikt i lacrimal kjertelorganoid etablering.
Riktig vedlikehold av lacrimal kjertelorganoider er viktig for deres bruk. Langsiktig vedlikehold er et kjennetegn på voksne stamcelleavledede lacrimal kjertelorganoider, sammenlignet med induserte pluripotente stamcelleavledede organoider 7,17. For å oppnå langsiktig vedlikehold bør regelmessig organoidsplitting og middels endringer utføres. Uten dette begynner organoider å differensiere og utvikle redusert stamcellepotensial, noe som hemmer deres langsiktige vedlikehold7. På dette trinnet igjen, kan over-fordøyelsen drepe stamceller og svekke organoid vedlikehold. For regelmessig vedlikehold er det ikke nødvendig med organoid dissosiasjon i enkeltceller. For å generere klonale knock-out organoide linjer er det imidlertid viktig å begynne med enkeltceller. Hvis ikke, vil organoidene bestå av en mosaikk av celler med forskjellig genetisk bakgrunn, noe som gjør det umulig å analysere effekten av en enkelt, definert mutasjon. Her beskriver vi bruken av en C- > T-baseeditor for å generere stoppkodoner. Denne genomeditoren er avhengig av tilstedeværelsen av arginin-, glutamin- eller tryptofankodoner innen 12-18 baser fra en NGG PAM. Når disse betingelsene ikke er oppfylt ved utforming av et gRNA, kan konvensjonelle Cas9- eller C >T-baseredigerere med alternative PAM-er brukes 7,18. Imidlertid introduserer konvensjonell Cas9 dobbeltstrengede brudd som resulterer i indels ved reparasjon11. Siden begge allelene kan ha forskjellige indels, krever klonegenotyping ekstra forsiktighet. Dekonvolusjon av de innførte modifikasjonene bør utføres for å sikre at begge allelene inneholder indels utenfor rammen, og dermed at organoidklonene blir slått ut for genet som er målrettet19. Fordelen med C- > T-baseredaktører ligger i det faktum at de kan brukes til å modellere punktmutasjoner som ikke nødvendigvis resulterer i stoppkodoner. For eksempel kan de brukes til å modellere spesifikke Pax6-mutasjoner funnet hos pasienter med aniridia for å studere deres innvirkning på lacrimal kjertelfysiologi20.
Lakrimalkjertelen utskiller den vandige delen av tårfilmen1. Tåresekresjon kan rekapituleres i humane organoider etter differensiering mediert av vekstfaktoruttak og NOTCH-hemming. Under disse forholdene gjennomgår organoider terminal differensiering og kan ikke opprettholdes ytterligere. Likevel kan differensierte lacrimal kjertelorganoider lede utviklingen av tårefremkallende stoffer i sammenheng med tørr øyesykdom, potensielt i skjermbilder med høy gjennomstrømning. Riveanalysen som presenteres i denne protokollen er den som for tiden gir den største endringen i organoidstørrelse på kort tid, noe som gjør det lettere å kvantifisere i sammenheng med en narkotikaskjerm 7,9,17.
Stamcellebehandling har stort løfte om lacrimal kjertel regenerering i tørr øyesykdom21. Voksne stamcelleavledede lacrimal kjertelorganoider kan være et kildemateriale for slike applikasjoner. Protokollen som presenteres her resulterer i human lacrimal gland organoid engraftment, hovedsakelig som cyster. Lav organoid engraftment kan oppstå på grunn av organoider som injiseres på feil sted. Trening av injeksjonsprosedyren med et fargestoff gjør det mulig å spore injeksjonsstedet og til slutt forbedre injeksjonsnøyaktigheten. Alternativt kan musepidermis snittes til å ha direkte tilgang til tårekjertelen, slik det gjøres hos rotter før22. Denne metoden tar lengre tid, men kan være mer nøyaktig. På den annen side, med den nåværende protokollen, ble organoidene ikke funksjonelt integrert i musens lacrimal kjertel. Lignende resultater er observert for iPSC-derivert tårekjerteltransplantasjon22. Transplantasjonsmetoden kan forbedres ytterligere ved å skade tårekjertelen på forhånd, ved hjelp av en tørr øyemusemodell og / eller injisere organoider som enkeltceller eller små klumper. Likevel kan voksne stamcelleavledede lacrimal kjertelorganoider og tilhørende verktøykasse være grunnlaget for fremtidige anvendelser i lacrimal kjertelforskning og regenerativ medisin.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Yorick Post for den første utviklingen av protokollen. Dette arbeidet ble delvis støttet av en pris fra Cancer Research UK Grand Challenge (C6307 / A29058) og Foundation for Cancer Research til SPECIFICANCER-teamet.
1.5 mL safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB) | Sigma-Aldrich | D5637 | CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 °C |
5x green GoTaq Flexi buffer | Promega | M891A | Store at -20 °C |
A83-01 | Tocris | 2939 | Store at -20 °C, stock at 30 mM, 10000x |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | store at 4 °C |
Agar plates containing Ampicillin | Hubrecht Institute | ||
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
Autoclave VAPOUR-Line lite | VWR chemicals | ||
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | Store at -20 °C, 50x |
BD Micro-Fine insulin needle 1 mL | BD Bioscience | 324825 | |
Benchtop microscope DMI1 | Leica | ||
Bovine serum albumine (BSA) | MP biomedicals | 160069 | Store at 4 °C |
BTXpress | BTX | MDS450805 | |
C57BL/6 mice | Hubrecht Institute | ||
Cassettes | Klinipath | 410-02S | |
CellBanker 1 | amsbio | 11910 | Cryopreservation medium, adhere to instructions |
Centrifuge | Eppendorf | ||
Citric acid monohydrate | J.T. Baker | 0088 | CAS: 5949-29-1 |
Collagenase I | Sigma Aldrich | C9407 | Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 °C |
Conical tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
Conical tubes 50 mL | Corning | CLS430828-500EA | |
Coverslips 24 mm x 50 mm | Menzel-Gläzer | BB024050S1 | |
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 – extracellular matrix | R&D Systems, Bio-Techne | 3533-001-02 | Store at -20 °C, keep at 4 °C for up to 1 month |
DAPT | Sigma Aldrich | D5942 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x |
Disodium hydrogen phosphate anhydrous | VWR chemicals | 28026.292 | CAS: 7558-79-4 |
Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | CAS:10028-24-7 |
Dispase | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | Aliquots at 50 U/mL, store at -20 °C until use, 400x |
Disposable Scalpel Sterile N° 10 | Swann Morton | 3033838 | |
DM4000 microscope | Leica | ||
dNTPs 25 mM | Promega | U1420 | Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 °C |
Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
Easy strainers 70 µm | Greiner | 542170 | |
Electroporation cuvette | Nepagene | EC002S | |
EnVision+/HRP mouse | Agilent | K400111-2 | |
Ethanol 100% | BOOM | 84045206;5000 | CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions |
Ethanol 70% | BOOM | 84010059.5000 | CAUTION |
Ethanol 96% | BOOM | 84050065.5000 | CAUTION |
EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | Live-imaging brightfield microscrope | |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Store at -20 °C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x |
Fiji | NIH, Fiji developers | ||
Formaldehyde solution 4% | Sigma-Aldrich | 1.00496 | CAS: 50-00-0, CAUTION |
Forskolin | Tocris | 1099 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100x |
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7805 | Store at -20 °C |
Haematoxylin | VWR chemicals | 10047105 | Store at room temperature |
HEPES | Gibco | 15630-080 | Store at 4 °C, 100x |
Histocore H and C, Tissue embedding machine | Leica | ||
Hot plate | Meidax | ||
Human nucleolar antigen antibody | Abcam | ab-190710 | |
Hydrochloric acid 5 N | ThermoFisher Scientific | 10605882 | CAS: 7647-01-0, CAUTION |
Hydrogen peroxyde 30% | Chem-lab | CL00.2308.1000 | CAS: 7722-84-1, CAUTION |
Hygromycin B-gold | InvivoGen | ant-hg | Stock at 100 mg/µL, 1000x |
Hygromycin resistance cassette-containing plasmid | Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156 | ||
IsoFlo 100% | Mecan | 5960501 | |
LB medium | Hubrecht Institute | ||
MgCl2 25 mM | Promega | A351H | Store at -20 °C |
Microtome RM2235 | Leica | ||
Midiprep DNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | K210005 | |
Miniprep DNA isolation kit | ThermoFisher scientific | K210003 | |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Store at -20 °C, stock at 500 mM, 400x |
NEPA21 electroporator | Nepagene | ||
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Store at -20 °C, stock at 1M, 100x |
NOD Scid Gamma (NSG) mice | Hubrecht Institute colony | ||
Noggin conditioned medium | U-Protein Express | Custom order | Store at -20 °C |
Noradrenaline | Sigma Aldrich | A7257 | Store at -20 °C, stock at 100 mM |
Oven | Memmert | Set at 58 °C | |
P20, P200 and P1000 pipettes | Gilson | ||
Paraffin | VWR chemicals | 10048502 | |
Pasteur pipettes, glass plugged | ThermoFisher Scientific | 1150-6973 | |
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG | IDT | ||
Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC | IDT | ||
pCMV_ABEmax_P2A_GFP | Addgene | 112101 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Store at -20 °C |
Pertex | Klinipath | AM-08010 | |
pFYF1320 | Addgene | 47511 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1000X, store at -20 °C |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x |
Petri dish, 10 cm | Greiner | 633102 | |
Q5 buffer | New England Biolabs | B9027S | |
Q5 high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | Store aliquots at -20 °C |
R-spondin 3 conditioned medium | U-Protein Express | Custom order | Store at -20 °C |
sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG | IDT | ||
Slides | StarFrost | MBB-0302-55A | Adhesive, ground |
Sodium azide | Merck | 8.22335.1000 | CAS: 26628-22-8, CAUTION |
Sodium cytrate dihydrate | J.T. Baker | 0280 | CAS: 6132-04-3 |
Standard Forward Primer: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC |
IDT | ||
Subcloning efficiency competent cells DH5alpha | Invitrogen | 18265-017 | |
Suspension cell culture plates (24-well) | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
Suspension cell culture plates (12-well) | Greiner Bio-One | 665102 | 12-well |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
TAE buffer | ThermoFisher Scientific | B49 | Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water |
Transposase-containing plasmid | Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156 | ||
TrypLE Express Enzyme | Invitrogen | 12605-028 | store at 4 °C |
U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT | IDT | ||
UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550 | |
Water bath | Tulabo | ||
Xylene | Klinipath | 4055-9005 | CAS: 1330-20-7, CAUTION |
Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x |