פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה לקביעת תאימות אבקה ואי התאמה בזני הדרים.
הדר משתמש באי-תאימות עצמית מבוססת S-RNase כדי לדחות אבקה עצמית, ולכן זקוק לעצי האבקה סמוכים לצורך האבקה ודישון מוצלחים. עם זאת, איתור זנים מתאימים שישמשו כמאביקים הוא תהליך שלוקח זמן. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו שיטה מהירה לזיהוי זני הדרים תואמי האבקה המשתמשת באלקטרופורזה של ג’ל אגרוז ובכתמים כחולים אנילין. תאימות האבקה נקבעת על סמך זיהוי גנוטיפים מסוג S על ידי חילוץ DNA כולל וביצוע בדיקות גנוטיפ מבוססות PCR עם פריימרים ספציפיים. בנוסף, סגנונות נאספים 3-4 ימים לאחר האבקה ידנית, וצביעת כחול אנילין מבוצעת. לבסוף, מצב הצמיחה של צינורות האבקה נצפה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאימות אבקה וחוסר תאימות ניתן לקבוע על ידי התבוננות אם צמיחת צינור אבקה הוא נורמלי או מדוכא, בהתאמה. בשל פשטותה ועלות-תועלתה, שיטה זו היא כלי יעיל לקביעת תאימות האבקה ואי התאימות של זני הדרים שונים כדי ליצור קבוצות אי-התאמה ויחסי אי-התאמה בין זנים שונים. שיטה זו מספקת מידע חיוני לבחירה מוצלחת של עצים מאביקים מתאימים, ובכך מאפשרת הקמת בוסתנים חדשים ובחירת הורים מתאימים לתוכניות רבייה.
אי-תאימות עצמית (SI) היא מנגנון מבוקר גנטית הקיים בכ-40% ממיני האנגיוספרם. בתהליך זה, הפיסטיל דוחה אבקה מצמח בעל אותו גנוטיפ SI, ובכך מונע הפריה עצמית 1,2. Ma jia pummelo הוא זן מקומי במחוז ג’ינגסו שבסין, עם איכויות מצוינות של פירות גדולים ורודים, תכולת מיץ עשירה, טעם מתוק וחמוץ, וקליפה עבה3. למרות ש-SI מקדם יציאה החוצה, הוא משפיע לרעה על היבול והאיכות של פירות4 ומחייב עצים מאביקים מתאימים עם גנוטיפים SI מובהקים לשיעורי קיבוע פירות אמינים ותשואות גבוהות. כיום, ישנם שני סוגים עיקריים של SI, אי-תאימות עצמית ספורופיטית (SSI), המיוצגת על-ידי Brassicaceae, ואי-תאימות עצמית גמטופיטית (GSI), המיוצגת על-ידי Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae ו-Solanaceae 5,6,7,8.
פרי הדר הוא אחד מגידולי הפרי החשובים בעולם. מערכת GSI מבוססת S-RNase נמצאת בהדרים רבים ומשפיעה לרעה על קצב קיבוע הפירות9. במערכת זו, SI נשלט על ידי מוקד S, מוקד פולימורפי יחיד עם שני אללים מורכבים הנושאים דטרמיננטים פיסטיל S ודטרמיננטים אבקה S 7. הדטרמיננטה הנקבית היא S ribonuclease (S-RNase), והדטרמיננטה הגברית היא S locus F-box (SLF)7. תאי הפיסטיל מפרישים חלבוני S-RNase. חלבוני ה-S-RNases שאינם עצמיים מוכרים על ידי חלבוני SLF, מה שמוביל ליוביקוויטינציה ולפירוק של ה-S-RNases הלא-עצמיים על ידי מסלול פרוטאזום 26S. לעומת זאת, ה-S-RNases העצמיים מסוגלים לצבור ולעכב את צמיחת צינור האבקה (PT) מכיוון שהם חומקים מחלבוני SLF, ולכן נמנעים מהם יוביקוויטינציה10,11,12,13.
כאן, אנו מדווחים על טכניקת in vivo השימושית לזיהוי גנוטיפים מסוג S ודרגות של תאימות וחוסר תאימות אבקה. הפרוטוקול כולל חילוץ DNA כולל מעלים וחיזוי גנוטיפ S באמצעות פריימרים ספציפיים ל-S. יתר על כן, צביעה כחולה אנילין ומיקרוסקופ פלואורסצנטי ואחריו האבקה ידנית מספקים ראיות למידת התאימות וחוסר ההתאמה. הליך האבקה Semi in vivo, הכולל האבקה ידנית של פרחים במעבדה14,15, הותאם גם הוא להערכת דרגות התאימות העצמית ואי ההתאמה. עם זאת, השתמשנו גם בהאבקה בשדה ואחריה בשקיעת פרחים כדי למנוע זיהום מאבקה לא רצויה כדי לאפשר לצינורות האבקה להתפתח בתנאים טבעיים. פרוטוקול זה פשוט ופשוט ומספק את המידע הדרוש לבחירה מוצלחת של עצי מאביקים מתאימים.
בגידולי פירות, הן parthenocarpy ו SI הן תכונות חשובות כי הם סוללים את הדרך פירות ללא זרעים – תכונה כי הוא מוערך מאוד על ידי הצרכנים. חוסר תאימות עצמית מקדם את דחיית האבקה העצמית, ובכך מונע רבייה20. בין הדרים, פומלו הוא זן שאינו תואם את עצמו7. כמעט 40% מכל מיני האנגיוספרם מציגים …
The authors have nothing to disclose.
פרויקט זה נתמך כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32122075, 32072523).
absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |