Determinazione delle relazioni di auto-(in)compatibilità e inter-(in)compatibilità negli agrumi mediante impollinazione manuale, microscopia e analisi del genotipo S
Summary
Questo protocollo fornisce un metodo rapido per determinare la compatibilità e l’incompatibilità del polline nelle cultivar di agrumi.
Abstract
Gli agrumi utilizzano l’auto-incompatibilità basata sulla S-RNasi per respingere l’auto-polline e, pertanto, richiedono alberi impollinatori vicini per un’impollinazione e una fecondazione di successo. Tuttavia, identificare le varietà adatte a fungere da impollinatori è un processo che richiede tempo. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un metodo rapido per identificare le cultivar di agrumi compatibili con l’impollinazione che utilizza l’elettroforesi su gel di agarosio e la colorazione blu all’anilina. La compatibilità del polline viene determinata sulla base dell’identificazione dei genotipi S estraendo il DNA totale ed eseguendo saggi di genotipizzazione basati sulla PCR con primer specifici. Inoltre, gli stili vengono raccolti 3-4 giorni dopo l’impollinazione manuale e viene eseguita la colorazione blu all’anilina. Infine, lo stato di crescita dei tubi pollinici viene osservato con un microscopio a fluorescenza. La compatibilità e l’incompatibilità del polline possono essere stabilite osservando se la crescita del tubo pollinico è normale o soppressa, rispettivamente. Grazie alla sua semplicità ed economicità, questo metodo è uno strumento efficace per determinare la compatibilità e l’incompatibilità del polline di diverse varietà di agrumi per stabilire gruppi di incompatibilità e relazioni di incompatibilità tra diverse cultivar. Questo metodo fornisce informazioni essenziali per la selezione di successo di alberi impollinatori adatti e, quindi, facilita la creazione di nuovi frutteti e la selezione di genitori appropriati per i programmi di allevamento.
Introduction
L’autoincompatibilità (SI) è un meccanismo geneticamente controllato presente in circa il 40% delle specie di angiosperme. In questo processo, il pistillo respinge il polline da una pianta con lo stesso genotipo SI e, quindi, impedisce l’autofecondazione 1,2. Ma jia pummelo è una varietà locale nella provincia di Jinagsu, in Cina, con le eccellenti qualità di frutta grande e rosa, un ricco contenuto di succo, un sapore agrodolce e una buccia spessa3. Sebbene il SI promuova l’outcrossing, influisce negativamente sulla resa e sulla qualità dei frutti4 e richiede alberi impollinatori adatti con genotipi SI distinti per tassi di allegagione affidabili e rese elevate. Allo stato attuale, ci sono due tipi principali di SI, l’autoincompatibilità sporofica (SSI), rappresentata dalle Brassicaceae, e l’autoincompatibilità gametofitica (GSI), rappresentata dalle Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae e Solanaceae 5,6,7,8.
Gli agrumi sono una delle colture frutticole più importanti al mondo. Il sistema GSI basato sulla S-RNasi si trova in molte accessioni di agrumi e influenza negativamente il tasso di allegagione9. In questo sistema, SI è controllato dal locus S, un singolo locus polimorfico con due alleli complessi che trasportano determinanti del pistillo S e determinanti del polline S 7. Il determinante femminile è la ribonucleasi S (S-RNasi) e il determinante maschile è il locus S F-box (SLF)7. Le cellule del pistillo secernono proteine S-RNasi. Le S-RNasi non-self sono riconosciute dalle proteine SLF, il che porta all’ubiquitinazione e alla degradazione delle non-self S-RNasi da parte della via del proteasoma 26S. Al contrario, le S-RNasi self sono in grado di accumulare e inibire la crescita del tubo pollinico (PT) perché eludono le proteine SLF e, quindi, sono impedite dall’ubiquitinizzazione10,11,12,13.
Qui riportiamo una tecnica in vivo utile per identificare i genotipi S e i gradi di compatibilità e incompatibilità del polline. Il protocollo prevede l’estrazione del DNA totale dalle foglie e la previsione del genotipo S utilizzando primer specifici per S. Inoltre, la colorazione blu all’anilina e la microscopia a fluorescenza seguita dall’impollinazione manuale forniscono prove del grado di compatibilità e incompatibilità. Anche la procedura di impollinazione semi in vivo, che prevede l’impollinazione manuale dei fiori de laboratorio14,15, è stata adattata per valutare i gradi di autocompatibilità e incompatibilità. Tuttavia, abbiamo anche utilizzato l’impollinazione sul campo seguita dall’insaccamento dei fiori per evitare la contaminazione da polline indesiderato per consentire ai tubi pollinici di svilupparsi in condizioni naturali. Questo protocollo è semplice e diretto e fornisce le informazioni necessarie per la selezione di successo degli alberi impollinatori adatti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nelle colture da frutto, sia la partenocarpia che l’SI sono tratti importanti perché aprono la strada a frutti senza semi – una caratteristica molto apprezzata dai consumatori. L’autoincompatibilità promuove il rifiuto dell’autopolline e, quindi, impedisce la consanguineità20. Tra gli agrumi, il pummelo è una varietà auto-incompatibile7. Quasi il 40% di tutte le specie di angiosperme presenta SI21. Questa caratteristica impedisce l’allegagione, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (32122075, 32072523).
Materials
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
Referências
- Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
- Goldberg, E. E., et al. Species selection maintains self-incompatibility. Science. 330 (6003), 493-495 (2010).
- Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo. China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).
- Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees. Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).
- Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility. Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).
- Meng, X., Sun, P., Kao, T. S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata. Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).
- Liang, M., et al. Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus. Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).
- Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen. Nature. 429, 305-309 (2004).
- Hu, J., et al. Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in "Guiyou No. 1" pummelo. Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).
- Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes. Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).
- Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation. The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).
- Hua, Z., Kao, T. Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility. Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).
- Entani, T., et al. Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction. The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).
- Abdallah, D. Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes. Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. . Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
- Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment. Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).
- Liang, M. Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus. , (2019).
- Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species. Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).
- Wei, Z., et al. Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources. Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).
- de Nettancourt, D. Incompatibility in angiosperms. Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).
- Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences. International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).
- Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping. Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).
