Questo protocollo fornisce un metodo rapido per determinare la compatibilità e l’incompatibilità del polline nelle cultivar di agrumi.
Gli agrumi utilizzano l’auto-incompatibilità basata sulla S-RNasi per respingere l’auto-polline e, pertanto, richiedono alberi impollinatori vicini per un’impollinazione e una fecondazione di successo. Tuttavia, identificare le varietà adatte a fungere da impollinatori è un processo che richiede tempo. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un metodo rapido per identificare le cultivar di agrumi compatibili con l’impollinazione che utilizza l’elettroforesi su gel di agarosio e la colorazione blu all’anilina. La compatibilità del polline viene determinata sulla base dell’identificazione dei genotipi S estraendo il DNA totale ed eseguendo saggi di genotipizzazione basati sulla PCR con primer specifici. Inoltre, gli stili vengono raccolti 3-4 giorni dopo l’impollinazione manuale e viene eseguita la colorazione blu all’anilina. Infine, lo stato di crescita dei tubi pollinici viene osservato con un microscopio a fluorescenza. La compatibilità e l’incompatibilità del polline possono essere stabilite osservando se la crescita del tubo pollinico è normale o soppressa, rispettivamente. Grazie alla sua semplicità ed economicità, questo metodo è uno strumento efficace per determinare la compatibilità e l’incompatibilità del polline di diverse varietà di agrumi per stabilire gruppi di incompatibilità e relazioni di incompatibilità tra diverse cultivar. Questo metodo fornisce informazioni essenziali per la selezione di successo di alberi impollinatori adatti e, quindi, facilita la creazione di nuovi frutteti e la selezione di genitori appropriati per i programmi di allevamento.
L’autoincompatibilità (SI) è un meccanismo geneticamente controllato presente in circa il 40% delle specie di angiosperme. In questo processo, il pistillo respinge il polline da una pianta con lo stesso genotipo SI e, quindi, impedisce l’autofecondazione 1,2. Ma jia pummelo è una varietà locale nella provincia di Jinagsu, in Cina, con le eccellenti qualità di frutta grande e rosa, un ricco contenuto di succo, un sapore agrodolce e una buccia spessa3. Sebbene il SI promuova l’outcrossing, influisce negativamente sulla resa e sulla qualità dei frutti4 e richiede alberi impollinatori adatti con genotipi SI distinti per tassi di allegagione affidabili e rese elevate. Allo stato attuale, ci sono due tipi principali di SI, l’autoincompatibilità sporofica (SSI), rappresentata dalle Brassicaceae, e l’autoincompatibilità gametofitica (GSI), rappresentata dalle Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae e Solanaceae 5,6,7,8.
Gli agrumi sono una delle colture frutticole più importanti al mondo. Il sistema GSI basato sulla S-RNasi si trova in molte accessioni di agrumi e influenza negativamente il tasso di allegagione9. In questo sistema, SI è controllato dal locus S, un singolo locus polimorfico con due alleli complessi che trasportano determinanti del pistillo S e determinanti del polline S 7. Il determinante femminile è la ribonucleasi S (S-RNasi) e il determinante maschile è il locus S F-box (SLF)7. Le cellule del pistillo secernono proteine S-RNasi. Le S-RNasi non-self sono riconosciute dalle proteine SLF, il che porta all’ubiquitinazione e alla degradazione delle non-self S-RNasi da parte della via del proteasoma 26S. Al contrario, le S-RNasi self sono in grado di accumulare e inibire la crescita del tubo pollinico (PT) perché eludono le proteine SLF e, quindi, sono impedite dall’ubiquitinizzazione10,11,12,13.
Qui riportiamo una tecnica in vivo utile per identificare i genotipi S e i gradi di compatibilità e incompatibilità del polline. Il protocollo prevede l’estrazione del DNA totale dalle foglie e la previsione del genotipo S utilizzando primer specifici per S. Inoltre, la colorazione blu all’anilina e la microscopia a fluorescenza seguita dall’impollinazione manuale forniscono prove del grado di compatibilità e incompatibilità. Anche la procedura di impollinazione semi in vivo, che prevede l’impollinazione manuale dei fiori de laboratorio14,15, è stata adattata per valutare i gradi di autocompatibilità e incompatibilità. Tuttavia, abbiamo anche utilizzato l’impollinazione sul campo seguita dall’insaccamento dei fiori per evitare la contaminazione da polline indesiderato per consentire ai tubi pollinici di svilupparsi in condizioni naturali. Questo protocollo è semplice e diretto e fornisce le informazioni necessarie per la selezione di successo degli alberi impollinatori adatti.
Nelle colture da frutto, sia la partenocarpia che l’SI sono tratti importanti perché aprono la strada a frutti senza semi – una caratteristica molto apprezzata dai consumatori. L’autoincompatibilità promuove il rifiuto dell’autopolline e, quindi, impedisce la consanguineità20. Tra gli agrumi, il pummelo è una varietà auto-incompatibile7. Quasi il 40% di tutte le specie di angiosperme presenta SI21. Questa caratteristica impedisce l’allegagione, …
The authors have nothing to disclose.
Questo progetto è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (32122075, 32072523).
absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |