Bestemmelse av selv-(u)kompatibilitet og inter-(in)kompatibilitetsrelasjoner i sitrus ved hjelp av manuell pollinering, mikroskopi og S-genotypeanalyser
Summary
Denne protokollen gir en rask metode for å bestemme pollenkompatibilitet og inkompatibilitet i sitruskultivarer.
Abstract
Sitrus bruker S-RNase-basert selvinkompatibilitet for å avvise selvpollen og krever derfor nærliggende polliniseringstrær for vellykket pollinering og befruktning. Imidlertid er det en tidkrevende prosess å identifisere egnede varianter som skal tjene som pollinisatorer. For å løse dette problemet har vi utviklet en rask metode for å identifisere pollineringskompatible sitruskultivarer som bruker agarosegelelektroforese og anilinblå farging. Pollenkompatibilitet bestemmes basert på identifisering av S-genotyper ved å ekstrahere totalt DNA og utføre PCR-baserte genotypingsanalyser med spesifikke primere. I tillegg samles stiler 3-4 dager etter manuell pollinering, og anilinblå farging utføres. Til slutt observeres vekststatusen til pollenrørene med et fluorescensmikroskop. Pollenkompatibilitet og inkompatibilitet kan etableres ved å observere om pollenrørets vekst er henholdsvis normal eller undertrykt. På grunn av sin enkelhet og kostnadseffektivitet er denne metoden et effektivt verktøy for å bestemme pollenkompatibiliteten og inkompatibiliteten til forskjellige sitrusvarianter for å etablere inkompatibilitetsgrupper og inkompatibilitetsforhold mellom forskjellige kultivarer. Denne metoden gir informasjon som er avgjørende for et vellykket utvalg av egnede pollineringstrær, og letter dermed etableringen av nye frukthager og valg av passende foreldre for avlsprogrammer.
Introduction
Selvinkompatibilitet (SI) er en genetisk kontrollert mekanisme som er tilstede i omtrent 40% av angiospermarter. I denne prosessen avviser pistilen pollen fra en plante med samme SI-genotype og forhindrer dermed selvbefruktning 1,2. Ma jia pummelo er et lokalt utvalg i Jinagsu-provinsen, Kina, med de utmerkede egenskapene til stor, rosa frukt, et rikt juiceinnhold, en søt og sur smak og en tykk peeling3. Selv om SI fremmer utparring, påvirker det utbyttet og kvaliteten på frukt4 negativt og nødvendiggjør egnede polliniseringstrær med forskjellige SI-genotyper for pålitelige fruktsettingshastigheter og høye utbytter. For tiden er det to hovedtyper av SI, sporofytisk selvinkompatibilitet (SSI), representert av Brassicaceae, og gametofytisk selvinkompatibilitet (GSI), representert av Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae og Solanaceae 5,6,7,8.
Sitrus er en av de viktigste fruktavlinger i verden. Det S-RNase-baserte GSI-systemet finnes i mange sitrustilganger og påvirker fruktinnstillingshastigheten9 negativt. I dette systemet styres SI av S-lokuset, et enkelt polymorft locus med to komplekse alleler som bærer pistil S-determinanter og pollen S-determinanter 7. Den kvinnelige determinanten er S ribonuklease (S-RNase), og den mannlige determinanten er S locus F-box (SLF)7. Cellene i pistilen utskiller S-RNase-proteiner. De ikke-selv-S-RNasene gjenkjennes av SLF-proteinene, noe som fører til ubiquitinering og nedbrytning av ikke-selv-S-RNasene ved 26S-proteasomveien. I motsetning til dette er de selv-S-RNasene i stand til å akkumulere og hemme pollenrør (PT) vekst fordi de unngår SLF-proteinene og derfor forhindres fra ubiquitinzation10,11,12,13.
Her rapporterer vi en in vivo-teknikk som er nyttig for å identifisere S-genotyper og grader av pollenkompatibilitet og inkompatibilitet. Protokollen innebærer å trekke ut totalt DNA fra blader og forutsi S-genotypen ved hjelp av S-spesifikke primere. Videre gir anilinblå farging og fluorescensmikroskopi etterfulgt av håndpollinering bevis for graden av kompatibilitet og inkompatibilitet. Semi in vivo pollineringsprosedyren, som innebærer manuell pollinering av blomster i laboratoriet14,15, har også blitt tilpasset for å vurdere graden av selvkompatibilitet og inkompatibilitet. Imidlertid har vi også brukt feltpollinering etterfulgt av bagging av blomster for å unngå forurensning fra uønsket pollen for å la pollenrørene utvikle seg under naturlige forhold. Denne protokollen er enkel og grei og gir den informasjonen som er nødvendig for vellykket valg av egnede pollineringstrær.
Protocol
Representative Results
Discussion
I fruktavlinger er både parthenocarpy og SI viktige egenskaper fordi de baner vei for frøfrie frukter – en egenskap som er høyt verdsatt av forbrukerne. Selvinkompatibilitet fremmer avvisning av selvpollen og forhindrer dermed innavl20. Blant sitrus er pummelo en selvinkompatibel variasjon7. Nesten 40% av alle angiospermarter utviser SI21. Denne egenskapen forhindrer fruktinnstilling, senker utbyttet og gir store økonomiske tap for dyrkere. For ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble støttet økonomisk av National Natural Science Foundation of China (32122075, 32072523).
Materials
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
Referências
- Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
- Goldberg, E. E., et al. Species selection maintains self-incompatibility. Science. 330 (6003), 493-495 (2010).
- Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo. China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).
- Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees. Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).
- Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility. Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).
- Meng, X., Sun, P., Kao, T. S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata. Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).
- Liang, M., et al. Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus. Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).
- Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen. Nature. 429, 305-309 (2004).
- Hu, J., et al. Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in "Guiyou No. 1" pummelo. Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).
- Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes. Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).
- Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation. The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).
- Hua, Z., Kao, T. Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility. Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).
- Entani, T., et al. Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction. The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).
- Abdallah, D. Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes. Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. . Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
- Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment. Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).
- Liang, M. Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus. , (2019).
- Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species. Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).
- Wei, Z., et al. Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources. Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).
- de Nettancourt, D. Incompatibility in angiosperms. Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).
- Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences. International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).
- Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping. Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).
