Определение взаимосвязи между цитрусовыми и взаимоотношениями с использованием ручного опыления, микроскопии и анализа S-генотипа
Summary
Этот протокол обеспечивает быстрый метод определения совместимости и несовместимости пыльцы у сортов цитрусовых.
Abstract
Цитрусовые используют самонесовместимость на основе S-РНКазы для отказа от самопыльцы и, следовательно, нуждаются в близлежащих деревьях-опылителях для успешного опыления и оплодотворения. Однако определение подходящих сортов для использования в качестве опылителей является трудоемким процессом. Чтобы решить эту проблему, мы разработали быстрый метод идентификации совместимых с опылением сортов цитрусовых, который использует электрофорез в агарозном геле и окрашивание анилиновым синим. Совместимость пыльцы определяется на основе идентификации S-генотипов путем выделения общей ДНК и проведения анализов генотипирования на основе ПЦР с конкретными праймерами. Дополнительно стайлы собирают через 3-4 дня после ручного опыления, и проводят окрашивание анилиновым синим. Наконец, состояние роста пыльцевых трубок наблюдается с помощью флуоресцентного микроскопа. Совместимость и несовместимость пыльцы можно установить, наблюдая за тем, является ли рост пыльцевой трубки нормальным или подавленным соответственно. Благодаря своей простоте и экономичности этот метод является эффективным инструментом для определения пыльцевой совместимости и несовместимости различных сортов цитрусовых для установления групп несовместимости и взаимосвязей несовместимости между различными сортами. Этот метод предоставляет информацию, необходимую для успешного выбора подходящих деревьев-опылителей, и, таким образом, облегчает создание новых садов и выбор подходящих родителей для селекционных программ.
Introduction
Самонесовместимость (СИ) является генетически контролируемым механизмом, присутствующим примерно у 40% покрытосеменных видов. В этом процессе пестик отторгает пыльцу растения с тем же генотипом SI и, таким образом, препятствует самооплодотворению 1,2. Ma jia pummelo — местный сорт в провинции Цзинагсу, Китай, с превосходными качествами крупных розовых плодов, богатым содержанием сока, кисло-сладким вкусом и толстой кожурой3. Несмотря на то, что СИ способствует ауткроссингу, он отрицательно влияет на урожайность и качество плодов4 и требует подходящих деревьев-опылителей с различными генотипами СИ для надежных темпов завязывания плодов и высоких урожаев. В настоящее время существует два основных типа СИ: спорофитная самонесовместимость (SSI), представленная Brassicaceae, и гаметофитная самонесовместимость (GSI), представленная Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae и Solanaceae 5,6,7,8.
Цитрусовые являются одной из самых важных фруктовых культур в мире. Система GSI на основе S-РНКазы содержится во многих образцах цитрусовых и отрицательно влияет на скорость завязывания плодов9. В этой системе SI контролируется локусом S, одним полиморфным локусом с двумя комплексными аллелями, которые несут S-детерминанты пестика и S-детерминанты пыльцы 7. Женский детерминант — S-рибонуклеаза (S-РНКаза), а мужской — F-бокс S-локуса (SLF)7. Клетки пестика секретируют белки S-РНКазы. Несобственные S-РНКазы распознаются белками SLF, что приводит к убиквитинированию и деградации несобственных S-РНКаз путем протеасомы 26S. Напротив, собственные S-РНКазы способны накапливать и ингибировать рост пыльцевой трубки (PT), поскольку они уклоняются от белков SLF и, следовательно, предотвращают убиквитинизацию10,11,12,13.
Здесь мы сообщаем о методе in vivo, который полезен для идентификации S-генотипов и степеней совместимости и несовместимости пыльцы. Протокол включает в себя извлечение общей ДНК из листьев и прогнозирование S-генотипа с использованием S-специфических праймеров. Кроме того, окрашивание анилиновым синим цветом и флуоресцентная микроскопия с последующим ручным опылением свидетельствуют о степени совместимости и несовместимости. Процедура опыления semi in vivo, которая включает ручное опыление цветов в лаборатории14,15, также была адаптирована для оценки степеней самосовместимости и несовместимости. Тем не менее, мы также использовали полевое опыление с последующим упаковыванием цветов в мешки, чтобы избежать загрязнения нежелательной пыльцой, чтобы пыльцевые трубки развивались в естественных условиях. Этот протокол прост и понятен и предоставляет информацию, необходимую для успешного выбора подходящих деревьев-опылителей.
Protocol
Representative Results
Discussion
В плодовых культурах как партенокарпия, так и SI являются важными признаками, потому что они прокладывают путь к бессемянным плодам – черта, которая высоко ценится потребителями. Самонесовместимость способствует отторжению самопыльцы и, таким образом, предотвращает инбридинг…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был финансово поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (32122075, 32072523).
Materials
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
Referências
- Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
- Goldberg, E. E., et al. Species selection maintains self-incompatibility. Science. 330 (6003), 493-495 (2010).
- Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo. China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).
- Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees. Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).
- Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility. Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).
- Meng, X., Sun, P., Kao, T. S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata. Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).
- Liang, M., et al. Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus. Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).
- Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen. Nature. 429, 305-309 (2004).
- Hu, J., et al. Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in "Guiyou No. 1" pummelo. Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).
- Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes. Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).
- Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation. The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).
- Hua, Z., Kao, T. Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility. Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).
- Entani, T., et al. Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction. The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).
- Abdallah, D. Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes. Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. . Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
- Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment. Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).
- Liang, M. Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus. , (2019).
- Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species. Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).
- Wei, Z., et al. Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources. Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).
- de Nettancourt, D. Incompatibility in angiosperms. Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).
- Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences. International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).
- Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping. Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).
