Determinación de las relaciones de autocompatibilidad e intercompatibilidad en cítricos mediante polinización manual, microscopía y análisis de genotipo S
Summary
Este protocolo proporciona un método rápido para determinar la compatibilidad e incompatibilidad del polen en cultivares de cítricos.
Abstract
Los cítricos utilizan la autoincompatibilidad basada en S-RNasa para rechazar el autopolen y, por lo tanto, requieren árboles polinizadores cercanos para una polinización y fertilización exitosas. Sin embargo, la identificación de variedades adecuadas para servir como polinizadores es un proceso que requiere mucho tiempo. Para resolver este problema, hemos desarrollado un método rápido para identificar cultivares de cítricos compatibles con la polinización que utiliza electroforesis en gel de agarosa y tinción de azul de anilina. La compatibilidad del polen se determina en función de la identificación de genotipos S mediante la extracción de ADN total y la realización de ensayos de genotipado basados en PCR con cebadores específicos. Además, los estilos se recolectan 3-4 días después de la polinización manual y se realiza la tinción de azul de anilina. Finalmente, el estado de crecimiento de los tubos polínicos se observa con un microscopio de fluorescencia. La compatibilidad e incompatibilidad del polen se puede establecer observando si el crecimiento del tubo polínico es normal o suprimido, respectivamente. Debido a su simplicidad y rentabilidad, este método es una herramienta eficaz para determinar la compatibilidad e incompatibilidad del polen de diferentes variedades de cítricos para establecer grupos de incompatibilidad y relaciones de incompatibilidad entre diferentes cultivares. Este método proporciona información esencial para la selección exitosa de árboles polinizadores adecuados y, por lo tanto, facilita el establecimiento de nuevos huertos y la selección de padres apropiados para los programas de reproducción.
Introduction
La autoincompatibilidad (IS) es un mecanismo genéticamente controlado presente en aproximadamente el 40% de las especies de angiospermas. En este proceso, el pistilo rechaza el polen de una planta con el mismo genotipo SI y, por lo tanto, impide la autofertilización 1,2. Ma jia pummelo es una variedad local en la provincia de Jinagsu, China, con las excelentes cualidades de fruta grande y rosada, un rico contenido de jugo, un sabor agridulce y una cáscara gruesa3. Aunque la IS promueve el cruzamiento, afecta negativamente el rendimiento y la calidad de las frutas4 y requiere árboles polinizadores adecuados con genotipos IS distintos para tasas confiables de cuajado de frutos y altos rendimientos. En la actualidad, hay dos tipos principales de SI, la autoincompatibilidad esporofítica (SSI), representada por Brassicaceae, y la autoincompatibilidad gametofítica (GSI), representada por Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae y Solanaceae 5,6,7,8.
Los cítricos son uno de los cultivos frutales más importantes del mundo. El sistema GSI basado en S-RNasa se encuentra en muchas accesiones de cítricos e influye negativamente en la tasa de cuajado de frutos9. En este sistema, el SI está controlado por el locus S, un único locus polimórfico con dos alelos complejos que transportan determinantes de pistilo S y determinantes de polen S 7. El determinante femenino es la S ribonucleasa (S-RNasa), y el determinante masculino es el locus S F-box (SLF)7. Las células del pistilo secretan proteínas S-RNasa. Las S-RNasas no propias son reconocidas por las proteínas SLF, lo que conduce a la ubiquitinación y degradación de las S-RNasas no propias por la vía del proteasoma 26S. En contraste, las auto-RNasas S son capaces de acumular e inhibir el crecimiento del tubo polínico (PT) porque evaden las proteínas SLF y, por lo tanto, se les impide la ubiquitinzación10,11,12,13.
Aquí, informamos una técnica in vivo que es útil para identificar genotipos S y grados de compatibilidad e incompatibilidad del polen. El protocolo consiste en extraer ADN total de las hojas y predecir el genotipo S utilizando cebadores específicos de S. Además, la tinción con azul de anilina y la microscopía de fluorescencia seguida de polinización manual proporcionan evidencia del grado de compatibilidad e incompatibilidad. El procedimiento de polinización semi in vivo, que consiste en la polinización manual de flores en el laboratorio14,15, también ha sido adaptado para evaluar los grados de autocompatibilidad e incompatibilidad. Sin embargo, también hemos utilizado la polinización de campo seguida del embolsado de flores para evitar la contaminación del polen no deseado para permitir que los tubos de polen se desarrollen en condiciones naturales. Este protocolo es simple y directo y proporciona la información necesaria para la selección exitosa de árboles polinizadores adecuados.
Protocol
Representative Results
Discussion
En los cultivos frutales, tanto la partenocarpia como la IS son rasgos importantes porque allanan el camino para las frutas sin semillas, un rasgo muy apreciado por los consumidores. La autoincompatibilidad promueve el rechazo del autopolen y, por lo tanto, previene la endogamia20. Entre los cítricos, el pummelo es una variedad autoincompatible7. Casi el 40% de todas las especies de angiospermas exhiben SI21. Este rasgo evita el cuajado de la fruta,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32122075, 32072523).
Materials
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
Referências
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