Bestämning av själv-(in)kompatibilitet och inter-(in) kompatibilitetsrelationer i citrus med hjälp av manuell pollinering, mikroskopi och S-genotypanalyser
Summary
Detta protokoll ger en snabb metod för att bestämma pollenkompatibilitet och inkompatibilitet i citrussorter.
Abstract
Citrus använder S-RNase-baserad självinkompatibilitet för att avvisa självpollen och kräver därför närliggande pollineringsträd för framgångsrik pollinering och befruktning. Att identifiera lämpliga sorter för att fungera som pollinisatorer är dock en tidskrävande process. För att lösa detta problem har vi utvecklat en snabb metod för att identifiera pollineringskompatibla citrussorter som använder agarosgelelektrofores och anilinblå färgning. Pollenkompatibilitet bestäms baserat på identifieringen av S-genotyper genom att extrahera totalt DNA och utföra PCR-baserade genotypanalyser med specifika primers. Dessutom samlas stilar 3-4 dagar efter manuell pollinering och anilinblå färgning utförs. Slutligen observeras pollenrörens tillväxtstatus med ett fluorescensmikroskop. Pollenkompatibilitet och inkompatibilitet kan fastställas genom att observera om pollenrörets tillväxt är normal respektive undertryckt. På grund av sin enkelhet och kostnadseffektivitet är denna metod ett effektivt verktyg för att bestämma pollenkompatibiliteten och inkompatibiliteten hos olika citrussorter för att fastställa inkompatibilitetsgrupper och inkompatibilitetsförhållanden mellan olika sorter. Denna metod ger information som är nödvändig för ett framgångsrikt urval av lämpliga pollineringsträd och underlättar därmed inrättandet av nya fruktträdgårdar och valet av lämpliga föräldrar för avelsprogram.
Introduction
Självinkompatibilitet (SI) är en genetiskt kontrollerad mekanism som finns i cirka 40% av angiospermarterna. I denna process avvisar pistilen pollen från en växt med samma SI-genotyp och förhindrar därmed självbefruktning 1,2. Ma jia pummelo är en lokal sort i Jinagsu-provinsen, Kina, med de utmärkta egenskaperna hos stor, rosa frukt, ett rikt juiceinnehåll, en söt och sur smak och en tjock skal3. Även om SI främjar utkorsning, påverkar det negativt avkastningen och kvaliteten på frukt4 och kräver lämpliga pollineringsträd med distinkta SI-genotyper för tillförlitliga fruktinställningshastigheter och höga utbyten. För närvarande finns det två huvudtyper av SI, sporofytisk självinkompatibilitet (SSI), representerad av Brassicaceae, och gametofytisk självinkompatibilitet (GSI), representerad av Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae och Solanaceae 5,6,7,8.
Citrus är en av de viktigaste fruktgrödorna i världen. Det S-RNase-baserade GSI-systemet finns i många citrusaccessioner och påverkar fruktsättningshastigheten negativt9. I detta system styrs SI av S-lokus, en enda polymorf plats med två komplexa alleler som bär pistil S-determinanter och pollen S-determinanter 7 . Den kvinnliga determinanten är S-ribonukleas (S-RNase), och den manliga determinanten är S-locus F-box (SLF)7. Pistilens celler utsöndrar S-RNas-proteiner. De icke-själv S-RNaserna känns igen av SLF-proteinerna, vilket leder till ubiquitinering och nedbrytning av icke-själv S-RNaserna av 26S-proteasomvägen. Däremot kan själv-S-RNaserna ackumulera och hämma pollenrörstillväxt (PT) eftersom de undviker SLF-proteinerna och därför förhindras från ubiquitinzation10,11,12,13.
Här rapporterar vi en in vivo-teknik som är användbar för att identifiera S-genotyper och grader av pollenkompatibilitet och inkompatibilitet. Protokollet innebär att extrahera totalt DNA från löv och förutsäga S-genotypen med hjälp av S-specifika primrar. Dessutom ger anilinblå färgning och fluorescensmikroskopi följt av handpollinering bevis för graden av kompatibilitet och inkompatibilitet. Semi in vivo-pollineringsproceduren, som innebär manuell pollinering av blommor i laboratoriet14,15, har också anpassats för att bedöma graden av självkompatibilitet och inkompatibilitet. Men vi har också använt fältpollinering följt av påsning av blommor för att undvika kontaminering från oönskat pollen för att låta pollenrören utvecklas under naturliga förhållanden. Detta protokoll är enkelt och okomplicerat och ger den information som behövs för ett framgångsrikt urval av lämpliga pollineringsträd.
Protocol
Representative Results
Discussion
I fruktgrödor är både parthenocarpy och SI viktiga egenskaper eftersom de banar väg för fröfria frukter – ett drag som uppskattas mycket av konsumenterna. Självinkompatibilitet främjar avstötningen av självpollen och förhindrar därmed inavel20. Bland citrus är pummelo en självinkompatibel sort7. Nästan 40% av alla angiospermarter uppvisar SI21. Denna egenskap förhindrar fruktsättning, sänker avkastningen och medför stora ekonomiska…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt stöddes ekonomiskt av National Natural Science Foundation of China (32122075, 32072523).
Materials
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
Referências
- Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
- Goldberg, E. E., et al. Species selection maintains self-incompatibility. Science. 330 (6003), 493-495 (2010).
- Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo. China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).
- Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees. Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).
- Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility. Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).
- Meng, X., Sun, P., Kao, T. S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata. Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).
- Liang, M., et al. Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus. Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).
- Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen. Nature. 429, 305-309 (2004).
- Hu, J., et al. Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in "Guiyou No. 1" pummelo. Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).
- Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes. Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).
- Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation. The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).
- Hua, Z., Kao, T. Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility. Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).
- Entani, T., et al. Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction. The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).
- Abdallah, D. Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes. Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. . Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
- Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment. Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).
- Liang, M. Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus. , (2019).
- Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species. Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).
- Wei, Z., et al. Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources. Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).
- de Nettancourt, D. Incompatibility in angiosperms. Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).
- Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences. International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).
- Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping. Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).
