Concentration de particules virales provenant d’échantillons d’eau et d’eaux usées prélevés dans l’environnement par floculation et ultrafiltration du lait écrémé

Summary

La concentration de virus à partir d’échantillons d’eau et d’eaux usées dans l’environnement est une tâche difficile, effectuée principalement pour l’identification et la quantification des virus. Bien que plusieurs méthodes de concentration virale aient été développées et testées, nous démontrons ici l’efficacité de l’ultrafiltration et de la floculation du lait écrémé pour les virus à ARN avec différents types d’échantillons.

Abstract

L’épidémiologie basée sur l’eau et les eaux usées est apparue comme des méthodes alternatives pour surveiller et prédire l’évolution des épidémies dans les communautés. La récupération des fractions microbiennes, y compris les virus, les bactéries et les microeucaryotes à partir d’échantillons d’eaux usées et d’eau environnementale est l’une des étapes difficiles de ces approches. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur l’efficacité de récupération de l’ultrafiltration séquentielle et des méthodes de floculation de lait écrémé (SMF) utilisant l’ARN blindé comme virus test, qui est également utilisé comme contrôle par d’autres études. Une préfiltration avec des filtres à disque à membrane de 0,45 μm et 0,2 μm a été appliquée pour éliminer les particules solides avant l’ultrafiltration afin d’éviter le colmatage des dispositifs d’ultrafiltration. Les échantillons d’essai, traités avec la méthode d’ultrafiltration séquentielle, ont été centrifugés à deux vitesses différentes. Une vitesse accrue a entraîné une baisse des taux de récupération et de positivité de l’ARN blindé. D’autre part, SMF a entraîné des taux de récupération et de positivité relativement constants de l’ARN blindé. Des tests supplémentaires effectués avec des échantillons d’eau environnementale ont démontré l’utilité de SMF pour concentrer d’autres fractions microbiennes. La répartition des virus en particules solides pourrait avoir un impact sur les taux de récupération globaux, compte tenu de l’étape de préfiltration appliquée avant l’ultrafiltration des échantillons d’eaux usées. SMF avec préfiltration a donné de meilleurs résultats lorsqu’il est appliqué à des échantillons d’eau environnementale en raison de concentrations solides plus faibles dans les échantillons et donc de taux de séparation plus faibles dans les solides. Dans la présente étude, l’idée d’utiliser une méthode d’ultrafiltration séquentielle est née de la nécessité de diminuer le volume final des concentrés viraux pendant la pandémie de COVID-19, lorsque l’approvisionnement en dispositifs d’ultrafiltration couramment utilisés était limité et qu’il était nécessaire de développer d’autres méthodes de concentration virale.

Introduction

La détermination de la concentration effective de microorganismes dans les échantillons de surface et d’eaux usées pour l’analyse des communautés microbiennes et les études épidémiologiques est l’une des étapes importantes pour surveiller et prévoir l’évolution des éclosions dans les communautés ^1,2. La pandémie de COVID-19 a révélé l’importance d’améliorer les méthodes de concentration. La COVID-19 est apparue à la fin de 2019 et, en mars 2023, constitue toujours une menace pour la santé humaine, la vie sociale et l’économie. Les stratégies efficaces de surveillance et de contrôle visant à atténuer les répercussions des éclosions de COVID-19 dans les communautés sont devenues un sujet de recherche important, car de nouvelles vagues et variantes de la COVID-19 ont fait leur apparition en plus de la transmission et de la propagation rapides du virus, ainsi que des cas asymptomatiques non déclarés et non diagnostiqués ^3,4,5. L’utilisation de l’épidémiologie basée sur les eaux usées pour la COVID-19 par les organisations de la société civile, les agences gouvernementales et les services publics ou privés a été utile pour fournir rapidement des informations liées à l’épidémie et atténuer les impacts des épidémies de COVID-19 6,7,8,9. Cependant, la concentration de SARS-CoV-2, un virus à ARN enveloppé, dans les échantillons d’eaux usées pose toujours des défis¹⁰. Par exemple, l’un de ces défis est la répartition du SRAS-CoV-2 dans les solides d’eaux usées, ce qui peut avoir une incidence sur la récupération lorsque les solides sont éliminés pendant la concentration¹¹. Si tel est le cas, la quantification/évaluation devrait être axée sur les phases solide et aqueuse des échantillons d’eau environnementale, plutôt que sur la phase aqueuse seulement. En outre, le choix de la méthode de concentration peut être modifié en fonction des essais et des analyses en aval. La concentration de particules virales et d’agents pathogènes provenant d’échantillons environnementaux est devenue un sujet de recherche urgent avec les développements dans les domaines du séquençage et du microbiome.

Diverses méthodes de concentration virale ont été appliquées dans le domaine de la concentration virale à partir d’échantillons d’eau et d’eaux usées environnementales. Certaines méthodes couramment utilisées sont la filtration, la floculation de lait écrémé (SMF), l’adsorption/élution et la précipitation du polyéthylèneglycol^12-17. Parmi eux, le SMF a été considéré comme une méthode peu coûteuse et efficace, testée avec succès et appliquée pour récupérer des virus, y compris le SARS-CoV-2, des eaux usées et des eaux de surface^12,15,16,18. La procédure SMF est une approche relativement nouvelle qui est de plus en plus reconnue par de nombreuses études environnementales comme une méthodologie appropriée pour récupérer simultanément un large éventail de micro-organismes tels que des virus, des bactéries et des protozoaires à partir de tous les types d’échantillons d’eau, à savoir les échantillons de boues, d’eaux usées brutes, d’eaux usées et d’effluents¹⁹. Comparativement à d’autres méthodes connues de récupération de virus à partir d’échantillons environnementaux, comme l’ultrafiltration et l’élution glycine-alcaline, l’approche basée sur la lyophilisation ou l’ultracentrifugation et l’élution glycine-alcaline, la FMS a été signalée comme la méthode la plus efficace avec des taux de récupération et de détection virale plus élevés^18,20. Dans la présente étude, nous avons utilisé l’ARN blindé comme virus test pour évaluer l’efficacité de récupération des méthodes de concentration virale, y compris les tests pour évaluer la récupération du SARS-CoV-2^21,22.

Ici, nous avons testé des échantillons d’eaux usées et d’eau environnementale pour démontrer l’utilité de la SMF et d’une méthode d’ultrafiltration séquentielle pour concentrer les fractions microbiennes pour la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR), la métagénomique basée sur les séquences et le séquençage à amplicon profond. La SMF est une méthode relativement moins chère et optimale pour un plus grand volume d’échantillons par rapport aux méthodes d’ultrafiltration. L’idée d’utiliser une méthode d’ultrafiltration séquentielle est née de la nécessité de diminuer le volume final des concentrés viraux pendant la pandémie de COVID-19, lorsque l’approvisionnement en dispositifs d’ultrafiltration couramment utilisés était limité et qu’il était nécessaire de développer d’autres méthodes de concentration virale.

Protocol

1. Comparaison de l’ultrafiltration en série et de la floculation du lait écrémé avec les virus concentrés dans les échantillons d’eaux usées Préparation des échantillonsPrélever 2 L d’échantillons composites d’eaux usées brutes (influentes) proportionnels au débit sur 24 h. Des échantillons ont été prélevés dans les trois principales usines de traitement des eaux usées (STEP) de Winnipeg, au Canada, au cours de l’été et de l’automne 2020 (tablea…

Representative Results

Évaluation des méthodes de concentration de l’ARN viralLes six échantillons traités avec de l’UF-3k x g étaient positifs et ont donné lieu à une récupération de 13,38 % ± 8,14 % (figure 1). Un seul échantillon était positif lorsque les échantillons ont été traités avec de l’UF-7,5k x g. Tous les échantillons traités avec SMF étaient positifs et ont donné lieu à un taux de récupération de 15,27 % ± de 2,65 % (<strong class="…

Discussion

L’une des étapes critiques de cette étude est l’élimination des particules solides par l’application d’une étape de préfiltration avec des filtres à membrane de 0,2 μm et 0,45 μm. Compte tenu de la répartition des virus en particules solides, en particulier en virus enveloppés, la préfiltration peut entraîner une perte importante de récupération^virale30. Alors qu’une étape de préfiltration pour les méthodes d’ultrafiltration est presque toujours nécessaire pour les é…

Materials

0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5	Alfa Aesar	J62041AP	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters	VWR	66234	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters	VWR	60043	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444432	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control	Asuragen	49650	Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa	Pall	OD030C65	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa	Pall	MCP010C46	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)	Nalgene	3119-0050PK	Thermo Fisher Scientific
DNAse I	Invitrogen	18047019	Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2	Invitrogen	12027	Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm	Pall	12179	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution	Thermo Fisher Scientific	AC124210025	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit	Applied biosystems	A42358	Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water	Promega	P1197	Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump	Masterflex, Cole-Parmer instrument	7553-20	Thermo Fisher Scientific
pH meter	Denver instrument	RK-59503-25	Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1	Invitrogen	15593031	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit	Qiagen		Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	A34322	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit	Invitrogen	Q33231	Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi	Invitrogen	Q33238	Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit	Invitrogen	Q32855	Thermo Fisher Scientific
RNAse A	Invitrogen	EN0531	Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit	Qiagen	26000-50	Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder	Difco (BD Life Sciences)	DF0032173	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer	Alfa Aesar		Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater	VWR	RC8363-1	RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated	Pall	4621	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated	Pall	4622	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA