स्किम्ड मिल्क फ्लोक्यूलेशन और अल्ट्राफिल्ट्रेशन का उपयोग करके पर्यावरणीय जल और अपशिष्ट जल नमूनों से वायरस कणों की एकाग्रता
Summary
पर्यावरणीय जल और अपशिष्ट जल के नमूनों से वायरस एकाग्रता एक चुनौतीपूर्ण कार्य है, जो मुख्य रूप से वायरस की पहचान और परिमाणीकरण के लिए किया जाता है। जबकि कई वायरस एकाग्रता विधियों को विकसित और परीक्षण किया गया है, हम यहां विभिन्न नमूना प्रकारों के साथ आरएनए वायरस के लिए अल्ट्राफिल्ट्रेशन और स्किम्ड मिल्क फ्लोक्यूलेशन की प्रभावशीलता का प्रदर्शन करते हैं।
Abstract
जल और अपशिष्ट जल आधारित महामारी विज्ञान समुदायों में प्रकोप के पाठ्यक्रम की निगरानी और भविष्यवाणी करने के लिए वैकल्पिक तरीकों के रूप में उभरा है। अपशिष्ट जल और पर्यावरणीय जल के नमूनों से वायरस, बैक्टीरिया और माइक्रोयूकेरियोट्स सहित माइक्रोबियल अंशों की वसूली इन दृष्टिकोणों में चुनौतीपूर्ण चरणों में से एक है। इस अध्ययन में, हमने एक परीक्षण वायरस के रूप में बख्तरबंद आरएनए का उपयोग करके अनुक्रमिक अल्ट्राफिल्ट्रेशन और स्किम्ड मिल्क फ्लोक्यूलेशन (एसएमएफ) विधियों की वसूली दक्षता पर ध्यान केंद्रित किया, जिसका उपयोग कुछ अन्य अध्ययनों द्वारा नियंत्रण के रूप में भी किया जाता है। अल्ट्राफिल्ट्रेशन उपकरणों के क्लॉगिंग को रोकने के लिए अल्ट्राफिल्ट्रेशन से पहले ठोस कणों को खत्म करने के लिए 0.45 μm और 0.2 μm झिल्ली डिस्क फिल्टर के साथ प्रीफिल्ट्रेशन लागू किया गया था। अनुक्रमिक अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधि के साथ संसाधित परीक्षण नमूने, दो अलग-अलग गति से सेंट्रीफ्यूज किए गए थे। एक बढ़ी हुई गति के परिणामस्वरूप बख्तरबंद आरएनए की कम वसूली और सकारात्मकता दर हुई। दूसरी ओर, एसएमएफ के परिणामस्वरूप बख्तरबंद आरएनए की अपेक्षाकृत सुसंगत वसूली और सकारात्मकता दर हुई। पर्यावरणीय पानी के नमूनों के साथ किए गए अतिरिक्त परीक्षणों ने अन्य माइक्रोबियल अंशों को केंद्रित करने के लिए एसएमएफ की उपयोगिता का प्रदर्शन किया। ठोस कणों में वायरस के विभाजन से समग्र वसूली दर पर प्रभाव पड़ सकता है, अपशिष्ट जल के नमूनों के अल्ट्राफिल्ट्रेशन से पहले लागू प्रीफिल्ट्रेशन चरण पर विचार करते हुए। नमूनों में कम ठोस सांद्रता के कारण पर्यावरणीय पानी के नमूनों पर लागू होने पर प्रीफिल्ट्रेशन के साथ एसएमएफ ने बेहतर प्रदर्शन किया और इस प्रकार ठोस पदार्थों के लिए कम विभाजन दर हुई। वर्तमान अध्ययन में, अनुक्रमिक अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधि का उपयोग करने का विचार कोविड-19 महामारी के दौरान वायरल सांद्रता की अंतिम मात्रा को कम करने की आवश्यकता से उत्पन्न हुआ, जब आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले अल्ट्राफिल्ट्रेशन उपकरणों की आपूर्ति सीमित थी, और वैकल्पिक वायरल एकाग्रता विधियों के विकास की आवश्यकता थी।
Introduction
माइक्रोबियल समुदाय विश्लेषण और महामारी विज्ञान अध्ययन के लिए सतह और अपशिष्ट जल के नमूनों में सूक्ष्मजीवों की प्रभावी एकाग्रता का निर्धारण करना, समुदायों में प्रकोप के पाठ्यक्रम की निगरानी और भविष्यवाणी करने के लिए महत्वपूर्ण कदमों में से एक है। कोविड-19 महामारी ने एकाग्रता के तरीकों में सुधार के महत्व को उजागर किया। कोविड-19 2019 के अंत में उभरा और मार्च 2023 तक, अभी भी मानव स्वास्थ्य, सामाजिक जीवन और अर्थव्यवस्था के लिए खतरा बना हुआ है। समुदायों में कोविड-19 के प्रकोप के प्रभावों को कम करने के लिए प्रभावी निगरानी और नियंत्रण रणनीतिएक महत्वपूर्ण शोध विषय बन गया है, क्योंकि वायरस के तेजी से संचरण और प्रसार के साथ-साथ बिना रिपोर्ट और बिना लक्षणवाले मामलों के अलावा सीओवीआईडी -19 की नई लहरें और वेरिएंट उभर रहे हैं।. नागरिक समाज संगठनों, सरकारी एजेंसियों और सार्वजनिक या निजी उपयोगिताओं द्वारा कोविड-19 के लिए अपशिष्ट जल आधारित महामारी विज्ञान का उपयोग तेजी से प्रकोप से संबंधित जानकारी प्रदान करने और कोविड-19 के प्रकोप के प्रभावों को कमकरने में सहायक रहा है। हालांकि, अपशिष्ट जल के नमूनों में सार्स-सीओवी-2, एक आवरण आरएनए वायरस की एकाग्रता अभीभी चुनौतियां पैदा करती है। उदाहरण के लिए, इन चुनौतियों में से एक अपशिष्ट जल ठोस पदार्थों में सार्स-सीओवी-2 का विभाजन है, जो एकाग्रता11 के दौरान ठोस पदार्थों को समाप्त करने पर वसूली को प्रभावित कर सकता है। यदि यह मामला है, तो परिमाणीकरण / मूल्यांकन का ध्यान केवल जलीय चरण के बजाय पर्यावरणीय पानी के नमूनों के ठोस और जलीय दोनों चरणों पर होना चाहिए। इसके अलावा, एकाग्रता विधि की पसंद को डाउनस्ट्रीम परीक्षणों और विश्लेषणों के आधार पर संशोधित किया जा सकता है। पर्यावरणीय नमूनों से वायरस कणों और रोगजनकों की एकाग्रता अनुक्रमण और माइक्रोबायोम क्षेत्रों में विकास के साथ एक तत्काल शोध विषय बन गई है।
पर्यावरणीय जल और अपशिष्ट जल के नमूनों से वायरस एकाग्रता के क्षेत्र में विभिन्न वायरस एकाग्रता विधियों को लागू किया गया है। आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली कुछ विधियां निस्पंदन, स्किम्ड मिल्क फ्लोक्यूलेशन (एसएमएफ), सोखना / क्षालन, और पॉलीथीन ग्लाइकोल वर्षा12-17 हैं। उनमें से, एसएमएफ को एक सस्ता और प्रभावी तरीका माना गया है, जिसका सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया है, और अपशिष्ट जल और सतह के पानी से सार्स-सीओवी-2 सहित वायरस को पुनर्प्राप्त करनेके लिए लागू किया गया है। एसएमएफ प्रक्रिया एक अपेक्षाकृत नया दृष्टिकोण है जिसने कई पर्यावरणीय अध्ययनों के बीच सभी प्रकार के पानी के नमूनों, अर्थात् कीचड़, कच्चे सीवेज, अपशिष्ट जल और बहिस्त्रावके नमूनों से वायरस, बैक्टीरिया और प्रोटोजोआ जैसे सूक्ष्मजीवों की एक विस्तृत श्रृंखला को एक साथ पुनर्प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त पद्धति के रूप में बढ़ी हुई मान्यता प्राप्त की है।. जब अल्ट्राफिल्ट्रेशन और ग्लाइसिन-क्षारीय क्षालन, लियोफिलाइजेशन-आधारित दृष्टिकोण, या अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और ग्लाइसिन-क्षारीय क्षालन जैसे पर्यावरणीय नमूनों से वायरस को पुनर्प्राप्त करने के लिए अन्य ज्ञात पद्धतियों की तुलना में, एसएमएफ को उच्च वायरल रिकवरी और पहचान दर18,20 के साथ सबसे कुशल विधि के रूप में रिपोर्ट किया गया है।. वर्तमान अध्ययन में, हमने वायरस एकाग्रता विधियों की वसूली दक्षता का आकलन करने के लिए एक परीक्षण वायरस के रूप में बख्तरबंद आरएनए का उपयोग किया, जिसमें सार्स-सीओवी-2 रिकवरी21,22 का आकलन करने के लिए परीक्षण शामिल हैं।
यहां, हमने एसएमएफ की उपयोगिता और मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर), अनुक्रम-आधारित मेटाजेनोमिक्स और डीप-एम्प्लिकॉन अनुक्रमण के लिए माइक्रोबियल अंशों को केंद्रित करने के लिए एक अनुक्रमिक अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधि का प्रदर्शन करने के लिए अपशिष्ट जल और पर्यावरणीय जल के नमूनों का परीक्षण किया। एसएमएफ एक अपेक्षाकृत सस्ता तरीका है और अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधियों की तुलना में बड़ी मात्रा में नमूनों के लिए इष्टतम है। अनुक्रमिक अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधि का उपयोग करने का विचार कोविड-19 महामारी के दौरान वायरल सांद्रता की अंतिम मात्रा को कम करने की आवश्यकता से उत्पन्न हुआ, जब आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले अल्ट्राफिल्ट्रेशन उपकरणों की आपूर्ति सीमित थी, और वैकल्पिक वायरल एकाग्रता विधियों के विकास की आवश्यकता थी।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में महत्वपूर्ण चरणों में से एक 0.2 μm और 0.45 μm झिल्ली फिल्टर के साथ एक प्रीफिल्ट्रेशन चरण लागू करके ठोस कणों का उन्मूलन है। ठोस कणों, विशेष रूप से घिरे वायरस में वायरस के विभाजन को ध्यान में रखते हु?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनएसईआरसी एलायंस कोविड -19 ग्रांट (अवार्ड नंबर 431401363, 2020-2021, डॉ युआन और उयागुआरी-डिआज) द्वारा समर्थित किया गया था। एमयूडी विश्वविद्यालय अनुसंधान अनुदान कार्यक्रम (पुरस्कार संख्या 325201) को धन्यवाद देना चाहता है। जेएफ और जेजेडए दोनों दृश्य और स्वचालित रोग विश्लेषिकी (वाडा) स्नातक प्रशिक्षण कार्यक्रम द्वारा समर्थित हैं। केवाई और जेएफ दोनों को मिटैक्स एक्सिलरेट कार्यक्रम से फैलोशिप मिली। एमयूडी और उनके प्रयोगशाला सदस्यों (केवाई, जेएफ, जेजेडए) को एनएसईआरसी-डीजी (आरजीपीआईएन-2022-04508) और रिसर्च मैनिटोबा न्यू इन्वेस्टिगेटर ऑपरेटिंग ग्रांट (संख्या 5385) द्वारा समर्थित किया जाता है। विन्निपेग, मैनिटोबा शहर के लिए विशेष धन्यवाद। यह शोध मैनिटोबा विश्वविद्यालय में किया गया था। हम यह स्वीकार करना चाहते हैं कि मैनिटोबा विश्वविद्यालय के परिसर अनीशिनाबेग, क्री, ओजी-क्री, डकोटा और डेने लोगों की मूल भूमि पर और मेटिस राष्ट्र की मातृभूमि पर स्थित हैं।
Materials
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
Referências
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