탈지유 응집 및 한외여과를 사용한 환경 용수 및 폐수 샘플의 바이러스 입자 농도
Summary
환경 용수 및 폐수 샘플의 바이러스 농도는 주로 바이러스의 식별 및 정량화를 위해 수행되는 어려운 작업입니다. 여러 바이러스 농축 방법이 개발되고 테스트되었지만, 여기서는 다양한 샘플 유형을 가진 RNA 바이러스에 대한 한외여과 및 탈지유 응집의 효과를 입증합니다.
Abstract
물 및 폐수 기반 역학은 지역 사회의 발병 과정을 모니터링하고 예측하는 대체 방법으로 부상했습니다. 폐수 및 환경 용수 샘플에서 바이러스, 박테리아 및 미세진핵생물을 포함한 미생물 분획을 회수하는 것은 이러한 접근 방식에서 어려운 단계 중 하나입니다. 본 연구에서는 Armored RNA를 테스트 바이러스로 사용하는 순차적 한외여과 및 탈지유 응집(SMF) 방법의 회수 효율에 초점을 맞췄으며, 이는 일부 다른 연구에서도 대조군으로 사용됩니다. 0.45μm 및 0.2μm 멤브레인 디스크 필터를 사용한 사전 여과를 적용하여 한외여과 장치의 막힘을 방지하기 위해 한외여과 전에 고체 입자를 제거했습니다. 순차적 한외여과 방법으로 처리된 테스트 샘플을 두 가지 다른 속도로 원심분리했습니다. 속도가 증가하면 Armored RNA의 회복률과 양성률이 낮아졌습니다. 반면에 SMF는 Armored RNA의 비교적 일관된 회복률과 양성률을 보였습니다. 환경 용수 샘플로 수행된 추가 테스트는 다른 미생물 분획을 농축하기 위한 SMF의 유용성을 입증했습니다. 바이러스를 고체 입자로 분할하는 것은 폐수 샘플의 한외여과 전에 적용된 사전 여과 단계를 고려할 때 전체 회수율에 영향을 미칠 수 있습니다. 사전 여과 기능이 있는 SMF는 샘플의 고체 농도가 낮고 따라서 고체에 대한 분배 속도가 낮기 때문에 환경 용수 샘플에 적용할 때 더 나은 성능을 보였습니다. 본 연구에서는 코로나19 팬데믹 기간 동안 일반적으로 사용되는 한외여과 장치의 공급이 제한되어 바이러스 농축액의 최종 부피를 줄여야 할 필요성에서 순차적 한외여과법을 사용한다는 아이디어가 생겨났고, 대체 바이러스 농축법의 개발이 필요했습니다.
Introduction
미생물 군집 분석 및 역학 연구를 위한 지표 및 폐수 샘플에서 미생물의 유효 농도를 결정하는 것은 군집 1,2에서 발병 과정을 모니터링하고 예측하기 위한 중요한 단계 중 하나입니다. COVID-19 대유행은 집중력 개선의 중요성을 전개했습니다. COVID-19는 2019년 말에 등장했으며 2023년 3월 현재 여전히 인간의 건강, 사회 생활 및 경제에 위협이 되고 있습니다. COVID-19의 새로운 유행과 변종이 바이러스의 급속한 전파 및 확산과 더불어 출현하고 보고되지 않고 진단되지 않은 무증상 사례가 발생함에 따라 지역사회에서 COVID-19 발병의 영향을 완화하기 위한 효과적인 감시 및 통제 전략이 중요한 연구 주제가 되었습니다 3,4,5. 시민 사회 단체, 정부 기관 및 공공 또는 민간 유틸리티에서 COVID-19에 대한 폐수 기반 역학을 사용하는 것은 신속한 발병 관련 정보를 제공하고 COVID-19 발병의 영향을 완화하는 데 도움이 되었습니다 6,7,8,9. 그러나 폐수 샘플에서 외피 RNA 바이러스인 SARS-CoV-2의 농도는 여전히 문제를 제기합니다10. 예를 들어, 이러한 문제 중 하나는 폐수 고형물에서 SARS-CoV-2를 분할하는 것인데, 이는 농도11 동안 고형물이 제거될 때 회수에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 경우 정량화/평가의 초점은 수성상만이 아닌 환경 용수 샘플의 고체상과 수성상 모두에 있어야 합니다. 또한 농축 방법의 선택은 다운스트림 테스트 및 분석을 기반으로 수정할 수 있습니다. 환경 샘플에서 바이러스 입자와 병원체의 농도는 시퀀싱 및 마이크로바이옴 분야의 발전과 함께 시급한 연구 주제가 되었습니다.
환경 용수 및 폐수 샘플의 바이러스 농축 분야에서 다양한 바이러스 농축 방법이 적용되었습니다. 일반적으로 사용되는 몇 가지 방법은 여과, 탈지유 응집(SMF), 흡착/용출 및 폴리에틸렌 글리콜 침전12-17입니다. 그 중 SMF는 저렴하고 효과적인 방법으로 간주되어 폐수 및 지표수12,15,16,18에서 SARS-CoV-2를 포함한 바이러스를 성공적으로 테스트 및 회수하는 데 적용되었습니다. SMF 절차는 슬러지, 미처리 하수, 폐수 및 폐수 샘플과 같은 모든 유형의 물 샘플에서 바이러스, 박테리아 및 원생동물과 같은 광범위한 미생물을 동시에 회수하는 적절한 방법론으로 많은 환경 연구에서 인정을 받고 있는 비교적 새로운 접근 방식입니다19. 한외여과 및 글리신-알칼리 용출, 동결건조 기반 접근법 또는 초원심분리 및 글리신-알칼리 용출과 같은 환경 시료에서 바이러스를 회수하는 다른 알려진 방법론과 비교할 때, SMF는 더 높은 바이러스 회수율과 검출률을 가진 가장 효율적인 방법으로 보고되었다18,20. 본 연구에서는 SARS-CoV-2 회수 평가를 위한 테스트를 포함하여 바이러스 농축 방법의 회수 효율을 평가하기 위해 Armored RNA를 테스트 바이러스로 사용했습니다21,22.
여기에서 우리는 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR), 서열 기반 메타유전체학 및 심부 앰플리콘 시퀀싱을 위한 미생물 분획을 농축하기 위한 SMF 및 순차적 한외여과 방법의 유용성을 입증하기 위해 폐수 및 환경 용수 샘플을 테스트했습니다. SMF는 상대적으로 저렴한 방법이며 한외여과 방법에 비해 더 많은 양의 시료에 최적입니다. 순차적 한외여과법을 사용한다는 아이디어는 코로나19 팬데믹 기간 동안 일반적으로 사용되는 한외여과 장치의 공급이 제한되어 바이러스 농축액의 최종 부피를 줄여야 할 필요성에서 비롯되었으며, 대체 바이러스 농축 방법의 개발이 필요했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구의 중요한 단계 중 하나는 0.2μm 및 0.45μm 멤브레인 필터로 사전 여과 단계를 적용하여 고체 입자를 제거하는 것입니다. 바이러스를 고체 입자, 특히 외피 바이러스로 분할하는 것을 고려할 때, 사전 여과는 바이러스 회수에 상당한 손실을 초래할 수 있다30. 한외여과 장치의 막힘을 방지하기 위해 환경 및 폐수 시료의 경우 한외여과 방법에 대한 사전 여과 단계가 거의 항?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NSERC Alliance Covid-19 Grant(수상 번호 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan 및 Uyaguari-Díaz). MUD는 대학 연구 보조금 프로그램 (수상 번호 325201)에 감사드립니다. JF와 JZA는 모두 VADA(Visual and Automated Disease Analytics) 대학원 교육 프로그램의 지원을 받습니다. KY와 JF는 모두 Mitacs Accelerate 프로그램에서 펠로우십을 받았습니다. MUD와 그의 실험실 구성원(KY, JF, JZA)은 NSERC-DG(RGPIN-2022-04508) 및 Research Manitoba New Investigator Operating Grant(No 5385)의 지원을 받습니다. 매니토바 주 위니펙 시에 특별한 감사를 드립니다. 이 연구는 매니토바 대학교에서 수행되었습니다. 우리는 매니토바 대학교 캠퍼스가 Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota 및 Dene 민족의 원래 땅과 Métis Nation의 고향에 위치하고 있음을 인정하고 싶습니다.
Materials
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
Referências
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