Viruskonsentrasjon fra miljøvann- og avløpsvannprøver er en utfordrende oppgave, utført primært for identifisering og kvantifisering av virus. Mens flere viruskonsentrasjonsmetoder er utviklet og testet, demonstrerer vi her effektiviteten av ultrafiltrering og skummetmelkflokkulering for RNA-virus med forskjellige prøvetyper.
Vann- og avløpsbasert epidemiologi har dukket opp som alternative metoder for å overvåke og forutsi forløpet av utbrudd i lokalsamfunn. Gjenoppretting av mikrobielle fraksjoner, inkludert virus, bakterier og mikroeukaryoter fra avløpsvann og miljøvannprøver, er et av de utfordrende trinnene i disse tilnærmingene. I denne studien fokuserte vi på utvinningseffektiviteten av sekvensiell ultrafiltrering og skummet melkflokkulering (SMF) metoder ved bruk av pansret RNA som testvirus, som også brukes som kontroll av noen andre studier. Forfiltrering med 0,45 μm og 0,2 μm membranskivefiltre ble påført for å eliminere faste partikler før ultrafiltrering for å forhindre tilstopping av ultrafiltreringsenheter. Testprøver, behandlet med sekvensiell ultrafiltreringsmetode, ble sentrifugert med to forskjellige hastigheter. En økt hastighet resulterte i lavere utvinning og positivitetsrater av pansret RNA. På den annen side resulterte SMF i relativt konsistent utvinning og positivitetsrater av pansret RNA. Ytterligere tester utført med miljøvannprøver demonstrerte nytten av SMF for å konsentrere andre mikrobielle fraksjoner. Oppdeling av virus i faste partikler kan ha innvirkning på den totale utvinningsgraden, med tanke på forfiltreringstrinnet som ble brukt før ultrafiltrering av avløpsvannprøver. SMF med forfiltrering presterte bedre når den ble brukt på miljøvannprøver på grunn av lavere faste konsentrasjoner i prøvene og dermed lavere partisjoneringshastighet til faste stoffer. I denne studien oppsto ideen om å bruke en sekvensiell ultrafiltreringsmetode fra nødvendigheten av å redusere det endelige volumet av viruskonsentratene under COVID-19-pandemien, da tilførselen av de vanlige ultrafiltreringsenhetene var begrenset, og det var behov for utvikling av alternative virale konsentrasjonsmetoder.
Bestemmelse av effektiv konsentrasjon av mikroorganismer i overflate- og avløpsvannprøver for mikrobiell samfunnsanalyse og epidemiologiske studier, er et av de viktige trinnene for å overvåke og forutsi utbruddsforløpet i samfunn 1,2. COVID-19-pandemien utfoldet viktigheten av å forbedre konsentrasjonsmetodene. COVID-19 dukket opp i slutten av 2019 og utgjør fra mars 2023 fortsatt en trussel mot menneskers helse, sosiale liv og økonomien. Effektive overvåkings- og kontrollstrategier for å lindre virkningene av COVID-19-utbrudd i lokalsamfunn har blitt et viktig forskningstema, ettersom nye bølger og varianter av COVID-19 har dukket opp i tillegg til den raske overføringen og spredningen av viruset, samt urapporterte og udiagnostiserte asymptomatiske tilfeller 3,4,5. Bruken av avløpsvannbasert epidemiologi for COVID-19 av sivilsamfunnsorganisasjoner, offentlige etater og offentlige eller private verktøy har vært nyttig for å gi rask utbruddsrelatert informasjon og redusere virkningen av COVID-19-utbrudd 6,7,8,9. Konsentrasjonen av SARS-CoV-2, et innkapslet RNA-virus, i avløpsvannprøver gir imidlertid fortsatt utfordringer10. For eksempel er en av disse utfordringene partisjonering av SARS-CoV-2 i faste stoffer i avløpsvann, noe som kan påvirke utvinningen når de faste stoffene elimineres under konsentrasjon11. Hvis dette er tilfelle, bør fokus for kvantifisering / vurdering være på både faste og vandige faser av miljøvannprøver, i stedet for bare den vandige fasen. Videre kan valg av konsentrasjonsmetode modifiseres basert på nedstrømstester og analyser. Konsentrasjonen av viruspartikler og patogener fra miljøprøver har blitt et presserende forskningstema med utviklingen innen sekvensering og mikrobiomfelt.
Ulike viruskonsentrasjonsmetoder har blitt brukt innen viruskonsentrasjon fra miljøvann og avløpsvannprøver. Noen vanlige metoder er filtrering, skummet melkeflokkulering (SMF), adsorpsjon/eluering og polyetylenglykolutfelling12-17. Blant dem har SMF blitt ansett som en billig og effektiv metode, vellykket testet og brukt for å gjenopprette virus, inkludert SARS-CoV-2, fra avløpsvann og overflatevann12,15,16,18. SMF-prosedyren er en relativt ny tilnærming som har fått økt anerkjennelse blant mange miljøstudier som en hensiktsmessig metode for samtidig å gjenvinne et bredt spekter av mikroorganismer som virus, bakterier og protozoer fra alle typer vannprøver, nemlig slam, rå kloakk, avløpsvann og avløpsprøver19. Sammenlignet med andre kjente metoder for å gjenopprette virus fra miljøprøver som ultrafiltrering og glycin-alkalisk eluering, lyofiliseringsbasert tilnærming eller ultrasentrifugering og glycin-alkalisk eluering, har SMF blitt rapportert som den mest effektive metoden med høyere viral utvinning og deteksjonsrater18,20. I denne studien brukte vi pansret RNA som et testvirus for å vurdere utvinningseffektiviteten av viruskonsentrasjonsmetoder, inkludert tester for å vurdere SARS-CoV-2-utvinning21,22.
Her testet vi avløpsvann og miljøvannprøver for å demonstrere nytten av SMF og en sekvensiell ultrafiltreringsmetode for å konsentrere mikrobielle fraksjoner for kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR), sekvensbasert metagenomikk og dypamplikonsekvensering. SMF er en relativt billigere metode og optimal for et større prøvevolum sammenlignet med ultrafiltreringsmetoder. Ideen om å bruke en sekvensiell ultrafiltreringsmetode oppsto fra nødvendigheten av å redusere det endelige volumet av viruskonsentratene under COVID-19-pandemien, da tilførselen av de vanlige ultrafiltreringsenhetene var begrenset, og det var behov for utvikling av alternative virale konsentrasjonsmetoder.
Et av de kritiske trinnene i denne studien er eliminering av faste partikler ved å påføre et forfiltreringstrinn med 0,2 μm og 0,45 μm membranfiltre. Med tanke på partisjonering av virus i faste partikler, spesielt innkapslede virus, kan forfiltrering forårsake et betydelig tap i viral utvinning30. Mens et forfiltreringstrinn for ultrafiltreringsmetoder nesten alltid er nødvendig for miljø- og avløpsvannprøver for å forhindre at ultrafiltreringsenheter tettes, kan det være nødvendig …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NSERC Alliance Covid-19 Grant (Award No. 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan og Uyaguari-Díaz). MUD ønsker å takke University Research Grants Program (Award No. 325201). Både JF og JZA støttes av Visual and Automated Disease Analytics (VADA) graduate training program. KY og JF mottok begge stipend fra Mitacs Accelerate-programmet. MUD og hans laboratoriemedlemmer (KY, JF, JZA) støttes av NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) og Research Manitoba New Investigator Operating grant (No 5385). Spesiell takk til byen Winnipeg, Manitoba. Denne forskningen ble utført ved University of Manitoba. Vi ønsker å erkjenne at University of Manitoba campusene ligger på de opprinnelige landene i Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota og Dene folk og på hjemlandet til Métis Nation.
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |