Concentração de Partículas de Vírus de Amostras Ambientais de Água e Efluentes Usando Floculação e Ultrafiltração de Leite Desnatado

Summary

A concentração de vírus a partir de amostras ambientais de água e efluentes é uma tarefa desafiadora, realizada principalmente para a identificação e quantificação de vírus. Embora vários métodos de concentração viral tenham sido desenvolvidos e testados, demonstramos aqui a eficácia da ultrafiltração e floculação de leite desnatado para vírus de RNA com diferentes tipos de amostras.

Abstract

A epidemiologia baseada em água e esgoto tem emergido como métodos alternativos para monitorar e prever o curso de surtos em comunidades. A recuperação de frações microbianas, incluindo vírus, bactérias e microeucariotos de amostras de águas residuárias e ambientais é uma das etapas desafiadoras nessas abordagens. Neste estudo, focamos na eficiência de recuperação dos métodos de ultrafiltração sequencial e floculação de leite desnatado (FMS) usando RNA blindado como vírus teste, que também é usado como controle por alguns outros estudos. A pré-filtração com filtros de disco de membrana de 0,45 μm e 0,2 μm foi aplicada para eliminar partículas sólidas antes da ultrafiltração para evitar o entupimento dos dispositivos de ultrafiltração. As amostras-teste, processadas pelo método de ultrafiltração sequencial, foram centrifugadas em duas velocidades diferentes. Uma maior velocidade resultou em menores taxas de recuperação e positividade do RNA blindado. Por outro lado, a FME resultou em taxas de recuperação e positividade relativamente consistentes do RNA blindado. Testes adicionais realizados com amostras de água ambientais demonstraram a utilidade da FME para concentrar outras frações microbianas. A partição de vírus em partículas sólidas pode ter um impacto nas taxas gerais de recuperação, considerando a etapa de pré-filtração aplicada antes da ultrafiltração de amostras de águas residuais. A FME com pré-filtração apresentou melhor desempenho quando aplicada em amostras de água ambientais devido às menores concentrações de sólidos nas amostras e, portanto, menores taxas de partição para sólidos. No presente estudo, a ideia de usar um método de ultrafiltração sequencial surgiu da necessidade de diminuir o volume final dos concentrados virais durante a pandemia de COVID-19, quando o fornecimento dos dispositivos de ultrafiltração comumente usados era limitado, e havia uma necessidade para o desenvolvimento de métodos alternativos de concentração viral.

Introduction

A determinação da concentração efetiva de microrganismos em amostras de águas superficiais e residuárias para análise de comunidades microbianas e estudos epidemiológicos é uma das etapas importantes para monitorar e prever o curso de surtos em comunidades ^1,2. A pandemia de COVID-19, desdobrou a importância de melhorar os métodos de concentração. A COVID-19 surgiu no final de 2019 e, em março de 2023, ainda representa uma ameaça à saúde humana, à vida social e à economia. Estratégias eficazes de vigilância e controle para aliviar os impactos dos surtos de COVID-19 nas comunidades tornaram-se um importante tópico de pesquisa, à medida que novas ondas e variantes da COVID-19 têm surgido, além da rápida transmissão e disseminação do vírus, bem como casos assintomáticos não notificados e não diagnosticados ^3,4,5. O uso da epidemiologia baseada em águas residuais para COVID-19 por organizações da sociedade civil, agências governamentais e serviços públicos ou privados tem sido útil para fornecer informações rápidas relacionadas a surtos e mitigar os impactos de surtos de COVID-19 6,7,8,9. No entanto, a concentração de SARS-CoV-2, um vírus de RNA envelopado, em amostras de águas residuais ainda apresenta desafios¹⁰. Por exemplo, um desses desafios é a partição do SARS-CoV-2 em sólidos de águas residuais, o que pode impactar a recuperação quando os sólidos são eliminados durante a concentração¹¹. Se este for o caso, o foco da quantificação/avaliação deve ser nas fases sólida e aquosa das amostras de água ambiental, e não apenas na fase aquosa. Além disso, a escolha do método de concentração pode ser modificada com base em ensaios e análises a jusante. A concentração de partículas virais e patógenos a partir de amostras ambientais tornou-se um tópico de pesquisa urgente com desenvolvimentos nos campos de sequenciamento e microbioma.

Vários métodos de concentração de vírus têm sido aplicados no campo da concentração de vírus a partir de amostras ambientais de água e efluentes. Alguns métodos comumente utilizados são filtração, floculação de leite desnatado (FMS), adsorção/eluição e precipitação de polietilenoglicol^12-17. Dentre eles, o SMF tem sido considerado um método barato e eficaz, testado com sucesso e aplicado na recuperação de vírus, incluindo o SARS-CoV-2, de águas residuárias e superficiais^12,15,16,18. O procedimento SMF é uma abordagem relativamente nova que tem ganhado crescente reconhecimento entre muitos estudos ambientais como uma metodologia apropriada para recuperar simultaneamente uma ampla gama de microrganismos, como vírus, bactérias e protozoários, de todos os tipos de amostras de água, a saber, lodo, esgoto bruto, efluentes e amostras de efluentes¹⁹. Quando comparada a outras metodologias conhecidas para recuperar vírus de amostras ambientais, como ultrafiltração e eluição glicina-alcalina, abordagem baseada em liofilização ou ultracentrifugação e eluição glicina-alcalina, a FMM tem sido relatada como o método mais eficiente, com maiores taxas de recuperação e detecção viral^18,20. No presente estudo, usamos o RNA blindado como um vírus de teste para avaliar a eficiência da recuperação dos métodos de concentração do vírus, incluindo testes para avaliar a recuperação do SARS-CoV-2^21,22.

Aqui, testamos amostras de águas residuais e ambientais para demonstrar a utilidade da SMF e de um método de ultrafiltração sequencial para concentrar frações microbianas para reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), metagenômica baseada em sequência e sequenciamento de amplicon profundo. O SMF é um método relativamente mais barato e ideal para um volume maior de amostras em comparação com os métodos de ultrafiltração. A ideia de usar um método de ultrafiltração sequencial surgiu da necessidade de diminuir o volume final dos concentrados virais durante a pandemia de COVID-19, quando o fornecimento dos dispositivos de ultrafiltração comumente usados era limitado, e havia a necessidade do desenvolvimento de métodos alternativos de concentração viral.

Protocol

1. Comparação entre ultrafiltração seriada e floculação de leite desnatado para concentrar vírus em amostras de águas residuárias Preparo da amostraColetar 2 L de amostras de águas residuais compostas (influentes) compostas proporcionais ao fluxo de 24 horas. As amostras foram coletadas nas três principais estações de tratamento de águas residuais (ETEs) em Winnipeg, Canadá, durante o verão e o outono de 2020 (Tabela 1). Transportar as amostra…

Representative Results

Avaliação de métodos de concentração de RNA viralTodas as seis amostras processadas com UF-3k x g foram positivas e resultaram em 13,38% ± 8,14% de recuperação (Figura 1). Apenas uma amostra foi positiva quando as amostras foram processadas com UF-7,5k x g. Todas as amostras processadas com FML foram positivas e resultaram em recuperação de 15,27% ± 2,65% (Figura 1). As taxas médias de recuperação de UF-3K x g…

Discussion

Uma das etapas críticas neste estudo é a eliminação de partículas sólidas através da aplicação de uma etapa de pré-filtração com filtros de membrana de 0,2 μm e 0,45 μm. Considerando a partição de vírus em partículas sólidas, especialmente vírus envelopados, a pré-filtração pode causar uma perda significativa na recuperação viral³⁰. Embora uma etapa de pré-filtragem para métodos de ultrafiltração seja quase sempre necessária para amostras ambientais e de águas residu…

Materials

0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5	Alfa Aesar	J62041AP	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters	VWR	66234	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters	VWR	60043	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444432	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control	Asuragen	49650	Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa	Pall	OD030C65	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa	Pall	MCP010C46	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)	Nalgene	3119-0050PK	Thermo Fisher Scientific
DNAse I	Invitrogen	18047019	Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2	Invitrogen	12027	Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm	Pall	12179	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution	Thermo Fisher Scientific	AC124210025	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit	Applied biosystems	A42358	Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water	Promega	P1197	Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump	Masterflex, Cole-Parmer instrument	7553-20	Thermo Fisher Scientific
pH meter	Denver instrument	RK-59503-25	Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1	Invitrogen	15593031	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit	Qiagen		Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	A34322	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit	Invitrogen	Q33231	Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi	Invitrogen	Q33238	Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit	Invitrogen	Q32855	Thermo Fisher Scientific
RNAse A	Invitrogen	EN0531	Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit	Qiagen	26000-50	Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder	Difco (BD Life Sciences)	DF0032173	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer	Alfa Aesar		Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater	VWR	RC8363-1	RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated	Pall	4621	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated	Pall	4622	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA