Concentração de Partículas de Vírus de Amostras Ambientais de Água e Efluentes Usando Floculação e Ultrafiltração de Leite Desnatado

Resumo

A concentração de vírus a partir de amostras ambientais de água e efluentes é uma tarefa desafiadora, realizada principalmente para a identificação e quantificação de vírus. Embora vários métodos de concentração viral tenham sido desenvolvidos e testados, demonstramos aqui a eficácia da ultrafiltração e floculação de leite desnatado para vírus de RNA com diferentes tipos de amostras.

Resumo

A epidemiologia baseada em água e esgoto tem emergido como métodos alternativos para monitorar e prever o curso de surtos em comunidades. A recuperação de frações microbianas, incluindo vírus, bactérias e microeucariotos de amostras de águas residuárias e ambientais é uma das etapas desafiadoras nessas abordagens. Neste estudo, focamos na eficiência de recuperação dos métodos de ultrafiltração sequencial e floculação de leite desnatado (FMS) usando RNA blindado como vírus teste, que também é usado como controle por alguns outros estudos. A pré-filtração com filtros de disco de membrana de 0,45 μm e 0,2 μm foi aplicada para eliminar partículas sólidas antes da ultrafiltração para evitar o entupimento dos dispositivos de ultrafiltração. As amostras-teste, processadas pelo método de ultrafiltração sequencial, foram centrifugadas em duas velocidades diferentes. Uma maior velocidade resultou em menores taxas de recuperação e positividade do RNA blindado. Por outro lado, a FME resultou em taxas de recuperação e positividade relativamente consistentes do RNA blindado. Testes adicionais realizados com amostras de água ambientais demonstraram a utilidade da FME para concentrar outras frações microbianas. A partição de vírus em partículas sólidas pode ter um impacto nas taxas gerais de recuperação, considerando a etapa de pré-filtração aplicada antes da ultrafiltração de amostras de águas residuais. A FME com pré-filtração apresentou melhor desempenho quando aplicada em amostras de água ambientais devido às menores concentrações de sólidos nas amostras e, portanto, menores taxas de partição para sólidos. No presente estudo, a ideia de usar um método de ultrafiltração sequencial surgiu da necessidade de diminuir o volume final dos concentrados virais durante a pandemia de COVID-19, quando o fornecimento dos dispositivos de ultrafiltração comumente usados era limitado, e havia uma necessidade para o desenvolvimento de métodos alternativos de concentração viral.

Introdução

A determinação da concentração efetiva de microrganismos em amostras de águas superficiais e residuárias para análise de comunidades microbianas e estudos epidemiológicos é uma das etapas importantes para monitorar e prever o curso de surtos em comunidades ^1,2. A pandemia de COVID-19, desdobrou a importância de melhorar os métodos de concentração. A COVID-19 surgiu no final de 2019 e, em março de 2023, ainda representa uma ameaça à saúde humana, à vida social e à economia. Estratégias eficazes de vigilância e controle para aliviar os impactos dos surtos de COVID-19 nas comunidades tornaram-se um importante tóp....

Protocolo

1. Comparação entre ultrafiltração seriada e floculação de leite desnatado para concentrar vírus em amostras de águas residuárias

1. Preparo da amostra
   1. Coletar 2 L de amostras de águas residuais compostas (influentes) compostas proporcionais ao fluxo de 24 horas. As amostras foram coletadas nas três principais estações de tratamento de águas residuais (ETEs) em Winnipeg, Canadá, durante o verão e o outono de 2020 (Tabela 1).
   2. Transportar as amostras para o laboratório em frascos à prova de luz em uma caixa de gelo e processá-las dentro de 24 h. Coletar dados de características físico-químicas e biológicas de ág....

Resultados

Avaliação de métodos de concentração de RNA viral
Todas as seis amostras processadas com UF-3k x g foram positivas e resultaram em 13,38% ± 8,14% de recuperação (Figura 1). Apenas uma amostra foi positiva quando as amostras foram processadas com UF-7,5k x g. Todas as amostras processadas com FML foram positivas e resultaram em recuperação de 15,27% ± 2,65% (Figura 1). As taxas médias de recuperação de UF-3K x g e SMF foram s.......

Discussão

Uma das etapas críticas neste estudo é a eliminação de partículas sólidas através da aplicação de uma etapa de pré-filtração com filtros de membrana de 0,2 μm e 0,45 μm. Considerando a partição de vírus em partículas sólidas, especialmente vírus envelopados, a pré-filtração pode causar uma perda significativa na recuperação viral³⁰. Embora uma etapa de pré-filtragem para métodos de ultrafiltração seja quase sempre necessária para amostras ambientais e de águas residuais para evitar que os disposit.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tampão fosfato de sódio 0,2 M com pH 7,5	Alfa Aesar	J62041AP	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, EUA
0,2 μ m Filtros de disco de membrana Supor-200 de 47 mm	VWR	66234	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0,45 μ m Filtros de disco de membrana Supor-200 de 47 mm	VWR	60043	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444432	Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA
Controle de Processamento Quant IPC-1 de RNA Blindado	Asuragen	49650	Asuragen, Austin, TX, USA
Marca A, Dispositivo Centrífugo Jumbosep, 30-kDa	Pall	OD030C65	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Marca B, Dispositivo Centrífugo Avançado Microsep, 30-kDa	Pall	MCP010C46	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Tubos de centrífuga (50 ml)	Nalgene	3119-0050PK	Thermo Fisher
Scientific DNAse I	Invitrogen	18047019	Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2	Invitrogen	12027	Thermo Fisher Scientific
GWV Cápsulas de Amostragem de Água Subterrânea de Alta Capacidade - 0.45 µ m	Pall	12179	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Ácido clorídrico, solução padrão 1N	Thermo Fisher Scientific	AC124210025	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, EUA
Kit de isolamento de ácido ultranucleico do microbioma MagMAX	Applied biosystems	A42358	Thermo Fisher Scientific
Água livre de nuclease	Promega	P1197	Promega Corporation, Fitchburg, WI,
Bomba peristáltica	Masterflex, instrumento Cole-Parmer	7553-20 Medidor de	Thermo Fisher Scientific
	Instrumento	Denver RK-59503-25	Cole-Parmer. Este produto foi descontinuado
Fenol:clorofórmio:álcool isoamílico 25:24:1	Invitrogen	15593031	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, EUA
Primers e conjuntos de sondas	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, EUA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit	Qiagen Qiagen		Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	A34322	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Kit de ensaio Qubit 1X dsDNA de alta sensibilidade (HS)	Invitrogen	Q33231	Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorômetro, com WiFi	Invitrogen	Q33238	Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA Kit de ensaio de alta sensibilidade (HS)	Invitrogen	Q32855	Thermo Fisher Scientific
RNAse A	Invitrogen	EN0531	Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit	Qiagen	26000-50	Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, EUA
Leite em pó desnatado	Difco (BD Life Sciences)	DF0032173	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, EUA
Tampão de fosfato de sódio	Alfa Aesar		Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canadá
Água do mar sintética	VWR	RC8363-1	RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Dispositivos de Filtração a Vácuo - 0.1 µ m, 90 mm, irradiado com raios gama	Pall	4621	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Dispositivos de Filtração a Vácuo - 0.2 µ m, 90 mm, irradiado com radiação gama	Pall	4622	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
mercaptoetanol	Gibco	21985023	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

dos EUA pH -