BS3 kemisk tvärbindningsanalys avslöjar minskat GABAA-receptoruttryck på cellytan i mushjärnor under kroniska psykosociala stressförhållanden.
Ångest är ett tillstånd av känslor som varierande påverkar djurbeteenden, inklusive kognitiva funktioner. Beteendemässiga tecken på ångest observeras över djurriket och kan erkännas som antingen adaptiva eller maladaptiva svar på ett brett spektrum av stressmodaliteter. Gnagare ger en beprövad experimentell modell för translationella studier som behandlar de integrativa mekanismerna för ångest på molekylär, cellulär och kretsnivå. I synnerhet framkallar det kroniska psykosociala stressparadigmet maladaptiva svar som efterliknar ångest- / depressiva beteendefenotyper som är analoga mellan människor och gnagare. Medan tidigare studier visar signifikanta effekter av kronisk stress på neurotransmittorinnehållet i hjärnan, är effekten av stress på neurotransmittorreceptornivåer understuderad. I denna artikel presenterar vi en experimentell metod för att kvantifiera de neuronala ytnivåerna av neurotransmittorreceptorer hos möss under kronisk stress, särskilt med fokus på gamma-aminosmörsyra (GABA) receptorer, som är inblandade i regleringen av känslor och kognition. Med hjälp av den membranogenomträngliga irreversibla kemiska tvärbindaren, bissulfosuccinimidylsuberat (BS3), visar vi att kronisk stress signifikant nedreglerar yttillgängligheten av GABAA-receptorer i prefrontala cortex. De neuronala ytnivåerna av GABAA-receptorer är den hastighetsbegränsande processen för GABA-neurotransmission och kan därför användas som en molekylär markör eller en proxy för graden av ångest-/depressiv-liknande fenotyper i experimentella djurmodeller. Denna tvärbindningsmetod är tillämplig på en mängd olika receptorsystem för neurotransmittorer eller neuromodulatorer uttryckta i vilken hjärnregion som helst och förväntas bidra till en djupare förståelse av mekanismerna bakom känslor och kognition.
Neurotransmittorreceptorer lokaliseras antingen på den neuronala plasmamembranytan eller intracellulärt på endomembranen (t.ex. endosomen, endoplasmatisk retikulum [ER] eller trans-Golgi-apparaten) och skyttlar dynamiskt mellan dessa två fack beroende på inneboende fysiologiska tillstånd i neuroner eller som svar på yttre neurala nätverksaktiviteter 1,2. Eftersom nyligen utsöndrade neurotransmittorer framkallar sina fysiologiska funktioner främst genom den ytlokaliserade poolen av receptorer, är ytreceptornivåerna för en given neurotransmittor en av de kritiska determinanterna för dess signalkapacitet inom neuralkretsen3.
Flera metoder finns tillgängliga för att övervaka ytreceptornivåer i odlade neuroner, inklusive ytbiotinyleringsanalys4, immunofluorescensanalys med en specifik antikropp under icke-permeabiliserade förhållanden5 eller användning av en receptortransgen genetiskt smält med en pH-känslig fluorescerande optisk indikator (t.ex. pHluorin)6. Däremot är dessa tillvägagångssätt antingen begränsade eller opraktiska vid bedömning av ytreceptornivåer in vivo. Till exempel kan ytbiotinyleringsförfarandet inte vara praktiskt för bearbetning av stora mängder och provantal hjärnvävnader in vivo på grund av dess relativt höga pris och de efterföljande stegen som är nödvändiga för att rena de biotinylerade proteinerna på avidinkonjugerade pärlor. För neuroner inbäddade i tredimensionell hjärnarkitektur kan låg antikroppstillgänglighet eller svårigheter med mikroskopbaserad kvantifiering utgöra en signifikant begränsning för att bedöma ytreceptornivåerna in vivo. För att visualisera fördelningen av neurotransmittorreceptorer i intakta hjärnor kan icke-invasiva metoder, såsom positronemissionstomografi, användas för att mäta receptorbeläggning och uppskatta ytreceptornivåerna7. Detta tillvägagångssätt bygger dock kritiskt på tillgången på specifika radioligander, dyr utrustning och specialkompetens, vilket gör den mindre tillgänglig för rutinmässig användning av de flesta forskare.
Här beskrivs en enkel, mångsidig metod för att mäta ytreceptornivåer i experimentella djurhjärnor ex vivo med hjälp av en vattenlöslig, membranogenomtränglig kemisk tvärbindare, bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS3)8,9. BS3 riktar sig mot primära aminer i sidokedjan av lysinrester och kan kovalent tvärbinda proteiner i närheten av varandra. När hjärnskivor nyligen framställs från en region av intresse och inkuberas i en buffert innehållande BS3, korsbinds cellytereceptorerna med närliggande proteiner och omvandlas sålunda till arter med högre molekylvikt, medan de intracellulära endomembranassocierade receptorerna förblir omodifierade. Därför kan yt- och intracellulära receptorpooler separeras med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och kvantifieras med western blot med användning av antikroppar specifika för receptorn som ska studeras.
Oförutsägbar kronisk mild stress (UCMS) är ett väletablerat experimentellt paradigm för att inducera kronisk psykosocial stress hos gnagare10. UCMS framkallar ångest-/depressiva-liknande beteendefenotyper och kognitiva underskott via modulering av en rad neurotransmittorsystem, inklusive GABA och dess receptorer10,11. I synnerhet är α5-subenhetsinnehållande GABA A-receptorn (α5-GABAA R) inblandad i regleringen av minne och kognitiva funktioner12,13, vilket tyder på möjlig involvering av förändrade funktioner hos denna underenhet i UCMS-inducerade kognitiva underskott. I detta protokoll använde vi BS3-tvärbindningsanalysen för att kvantifiera nivåer av ytuttryckt α5-GABAAR i prefrontala cortex hos möss som exponerats för UCMS jämfört med icke-stressade kontrollmöss.
Även om effekterna av kronisk psykosocial stress på beteenden (dvs. emotionalitet och kognitiva underskott) och molekylära förändringar (dvs. minskat uttryck av GABAerga gener och åtföljande underskott i GABAergisk neurotransmission) är väldokumenterade10, behöver mekanismerna bakom sådana underskott undersökas ytterligare. I synnerhet, med tanke på den senaste studien som visar att kronisk stress signifikant påverkar det neuronala proteomet genom överbelastning på ER-funktionerna …
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar CAMH-djuranläggningens personal för att ta hand om djuren under studietiden. Detta arbete stöddes av Canadian Institute of Health Research (CIHR Project Grant #470458 till TT), Discovery Fund från CAMH (till TP), National Alliance for Research on Schizofreni och depression (NARSAD award # 25637 till ES) och Campbell Family Mental Health Research Institute (till ES). E.S. är grundare av Damona Pharmaceuticals, ett biopharma dedikerat till att föra nya GABAergic föreningar till kliniken.
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
Glycine | Sigma | W328707 | |
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors – Serrated |
Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors – Sharp |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |