Här presenterar vi en generell metod för att bestämma embryonal livskraft och totalt antal producerade embryon (yngel) med hjälp av modellorganismen C. elegans.
Caenorhabditis elegans är en utmärkt modellorganism för studier av meios, befruktning och embryonal utveckling. C. elegans existerar som självbefruktande hermafroditer, som producerar stora kullar av avkomma – när hanar är närvarande kan de producera ännu större kullar av korsavkomma. Fel i meios, befruktning och embryogenes kan snabbt bedömas som fenotyper av sterilitet, minskad fertilitet eller embryonal dödlighet. Denna artikel beskriver en metod för att bestämma embryonal livskraft och yngelstorlek hos C. elegans. Vi demonstrerar hur man ställer in denna analys genom att plocka en mask på en enskild modifierad ungens, enda bacco-peptonplatta (MYOB), fastställa lämplig tidsram för att räkna livskraftiga avkommor och icke-livskraftiga embryon och förklara hur man exakt räknar levande maskprover. Denna teknik kan användas för att bestämma livskraften vid självbefruktande hermafroditer samt korsbefruktning genom parningspar. Dessa relativt enkla experiment är lätt att anta för nya forskare, såsom studenter och förstaårsstudenter.
Sexuell reproduktion i eukaryota organismer kräver produktion av funktionella gameter som sammanfogar för att bilda ett embryo genom befruktningsprocessen. Maternal och faderlig gameter, ägg (ägg) och spermier skapas genom de specialiserade celldelnings- och differentieringsprocesserna för meios och gametogenes1. Meios börjar med en enda diploid cell och slutar med bildandet av dotterceller som innehåller hälften av antalet kromosomer i den ursprungliga föräldracellen. Från reduktion av ploidi till blandning av genetiskt material via oberoende sortiment och crossover-rekombination tjänar meios flera viktiga funktioner1. Fel inom meios kan resultera i aneuploidi, där det finns för många eller för få kromosomer i en könscell. Förekomsten av aneuploidi har enorma effekter på människors hälsa, eftersom kromosomala obalanser är en viktig orsak till missfall och utvecklingsstörningar som Downs syndrom och Edwards syndrom2.
Befruktning är den process genom vilken moder- och faderns gameter smälter samman för att generera en ny organism3. Gamete-gamete erkännande underlättas av proteiner på gamete ytan3. Fel med gametkompatibilitet leder till infertilitet eftersom spermier och äggfusion inte kan fortsätta. Fusionen av spermier med en oocyt utlöser en mängd händelser som leder till korrekt bildning av ett aktivt embryo som kan börja utvecklingsresan från ett encelligt embryo till en fullt fungerande multicellulär organism via mitotiska uppdelningar4. Under hela embryogenesen måste molekylära händelser som reglerar utvecklingen vara tätt reglerade och exakt tidsinställda för att möjliggöra korrekt tillväxt av organismen5. Korrekt celldifferentiering under tidig utveckling är avgörande när organismen övergår från ett pluripotent embryo till en fullvärdig organism. På grund av komplexiteten i dessa händelser kan störningar leda till utvecklingsdefekter som resulterar i embryonal dödlighet.
Caenorhabditis elegans är en utmärkt modellorganism för att studera meios, befruktning och embryonal utveckling. C. elegans är en genomskinlig nematod som har två kön, män och hermafroditer. C. elegans hermafroditer, som kan självbefruktas, är det dominerande könet 6,7. Hermafroditgonaden producerar först spermier under det fjärde larvstadiet (L4), som lagras i spermatheka. Vid övergången L4 till vuxen ålder växlar könslinjen till att producera äggceller, som sedan befruktas via de lagrade spermierna. Män, som uppstår i hermafroditer med en hastighet av mindre än 0,2%, producerar bara spermier och kan para sig med hermafroditer. Vid korsbefruktning konkurrerar manliga spermier ut hermafroditspermier vid befruktning av oocyter8. Detta möjliggör relativt enkelt underhåll av homozygota mutanter genom självbefruktande bestånd och för genetisk manipulation genom genetiska korsningar. De två könen möjliggör studier som undersöker skillnader mellan meios i manliga och kvinnliga könslinjer. Vidare, på grund av den transparenta naturen hos C. elegans och dess ägg, kan processerna för meios, gametogenes, befruktning och embryogenes studeras hos levande, intakta djur med hjälp av fluorescensavbildningstekniker.
Vid analys av nya mutationer i gener som kan spela en roll i meios, befruktning och / eller embryonal utveckling hos C. elegans, är ett avgörande första steg att bestämma embryonal livskraft och yngelstorlek eftersom fel i dessa processer ofta leder till ett misslyckande eller minskning av produktionen av livskraftig avkomma. Detta dokument beskriver ett protokoll för bedömning av fertilitet, embryonal livskraft och yngelstorlek från antingen självbefruktande hermafroditer eller korsningar mellan hermafroditer och män. Medan denna klassiska analys har använts i många C. elegans-studier , tillhandahåller vi ett standardiserat protokoll för installation och noggrann kvantifiering. I detta protokoll isoleras enskilda maskar eller hanar/hermafroditpar för att möjliggöra parning och avkommaproduktion. Avkommans produktion och livskraft observeras under en serie dagar för att fastställa antalet livsdugliga avkommor och icke-livsdugliga embryon. Vid experimentets slut analyseras enskilda kullar för att beräkna embryonal livskraftsprocent och total yngelstorlek.
Förökning av sexuellt reproducerande arter kräver bildandet av haploida gameter (dvs ägg och spermier) genom meios, som sedan förenas vid befruktning, återställer det diploida kromosomantalet och initierar embryonal utveckling. Fel i någon av dessa processer kan leda till infertilitet, embryonal dödlighet och / eller fosterskador. C. elegans är ett kraftfullt modellsystem för att studera sexuell reproduktion. Effekterna av genmutationer eller knockdown av genuttryck (t.ex. RNA-interferens) kan bedömas relativt snabbt och enkelt med hjälp av de embryonala livsduglighets- och yngelstorleksanalyser som beskrivs ovan. Vi har använt dessa metoder för initial karakterisering av gener involverade i meiotisk kromosomsegregering och befruktning/äggaktivering10,11,12. En observerad minskning av embryonal livskraft eller yngelstorlek indikerar en störning i meios, gametogenes, befruktning eller embryogenes.
Eftersom embryonal livskraft och yngelstorlek bedöms relativt enkelt genom att räkna avkomma och en enkel matematisk beräkning, är dessa optimala introduktionsexperiment för forskningsnybörjare antingen i laboratoriet eller klassrummet. Lättheten i C. elegans djurhållning och ekonomiska fördelar gör dem särskilt lämpade för experimentella biologikurser. Studenterna får värdefull forskningserfarenhet genom C. elegans djurhållning, lär sig att använda dissekeringsmikroskop och kan ställa biologiska frågor i ett utvecklingssystem som kan besvaras på relativt kort tid (cirka 5 dagar med protokollet som beskrivs i detta papper).
Tidpunkten för antalet avkommor är mycket viktig för embryonala viabilitetsanalyser. Vid 20 °C tar embryogenesen cirka 16 timmar, och reproduktivt mogna vuxna börjar lägga ägg cirka 60 timmar efter kläckning som L1-larver. Eftersom livscykeln är snabb är det viktigt att räkna avkomman inom lämplig fönster, så att embryona hinner kläckas tillräckligt innan avkomman själv börjar lägga ägg. Det är också viktigt att notera att tillväxtperioderna varierar beroende på temperatur. Tillväxten är ungefär 2,1 gånger snabbare vid 24-25 °C än 15-16 °C, och ungefär 1,3 gånger snabbare vid 20 °C än 15-16 °C13. I detta protokoll rekommenderar vi att räkningar sker 48 timmar efter att de vuxna har placerats på en ny tallrik. Denna tidsram säkerställer att alla embryon med vildtypsutveckling har tillräckligt med tid att kläckas (>16 timmar), men inte åldras till den grad att de är reproduktionsdugliga. Tester som utförs vid temperaturer lägre än 20 °C kan behöva förlängas (överföra djur i 4 dagar) för att embryon ska kläckas och för att kläckt avkomma ska nå larvstadier som är lättare att observera bland bakterierna på MYOB-plattorna (L3-L4-stadier).
En begränsning för embryonala livsduglighetsanalyser och yngelstorlek är att den specifika utvecklingsprocess som störs inte är uppenbar. Dessa initiala analyser kan dock följas upp med cytologiska tekniker för att bestämma vilken process som påverkas. Till exempel kan dissektion av de vuxna maskarna för att frigöra gonaden följt av 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) färgning och noggrann analys av DNA-morfologi inom könslinjen avslöja om meiotiska processer störs. Dessutom kan DAPI-färgning av embryon avslöja i vilket skede embryogenesen arresteras.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit ett protokoll för att analysera antalet producerade embryon (yngel) och andelen embryon som är livskraftiga för olika C. elegans-mutanter. Denna analys kan användas för både självbefruktande hermafroditer och för manliga/hermafroditkorsningar. Med den korta livscykeln för C. elegans kan detta protokoll slutföras på mindre än 1 vecka. Embryonala livsduglighetsanalyser och yngelstorlekar kan användas som första analyser av gener som är involverade i meios, befruktning eller embryonal utveckling, och är lämpliga protokoll för mer avancerade forskare och forskningsnybörjare (både studenter och förstaårsstudenter).
The authors have nothing to disclose.
Arbetet i Jaramillo-Lambert-laboratoriet stöds av National Institutes of Health NIGMS R35GM142524. Alla C. elegans-stammar tillhandahölls av Caenorhabditis Genetics Center, som finansieras av National Institutes of Health, P40 OD010440. Figur 1D skapades med hjälp av Biorender.com.
Materials | |||
35 mm Petri dishes | Tritech research | T3501 | Semi-stackable, non-vented. |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For MYOB |
Bacto-Peptone | Gibco | 211677 | For MYOB |
Cholestrol | Sigma | C8503 | For MYOB |
Sodium Chloride | J.T. Baker | FW 58.440 | For MYOB |
Trizma Base | Sigma | T1503 | For MYOB |
Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | For MYOB |
Strains | |||
C. elegans wild type strain | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | |
Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
him-5(e1490) | Caenorhabditis Genetics Center | DR466 | |
spo-11(ok79) | Caenorhabditis Genetics Center | AV106 | |
Equipment/software | |||
Differential cell counter | Fischer Scientific | 02-670-12 | |
MicroSoft Excel or Prism | MicroSoft or GraphPad | For recording and creating graphical representations of data. | |
platinum wire | Tritech research | PT9901 | For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick). |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.) |
worm pick handle | Tritech research | TWPH1 | For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette. |