Dette arbejde beskriver en protokol til kvantificering af globale histonmodifikationer ved anvendelse af intranukleær flowcytometri i isoleret hjernemikroglia. Arbejdet indeholder også microglia-isolationsprotokollen, der blev brugt til dataindsamling.
Genekspressionskontrol sker delvist ved ændringer i kromatinstruktur, herunder tilføjelse og fjernelse af posttranslationelle modifikationer til histonhaler. Histone posttranslationelle modifikationer (HPTM’er) kan enten lette genekspression eller undertrykkelse. For eksempel neutraliserer acetylering af histonhalelysinrester den positive ladning og reducerer interaktioner mellem halen og negativt ladet DNA. Faldet i histonhale-DNA-interaktioner resulterer i øget tilgængelighed af det underliggende DNA, hvilket giver mulighed for øget transkriptionsfaktoradgang. Acetyleringsmærket fungerer også som et genkendelsessted for bromdomæneholdige transkriptionelle aktivatorer, hvilket tilsammen resulterer i forbedret genekspression. Histonmærker kan reguleres dynamisk under celledifferentiering og som reaktion på forskellige cellulære miljøer og stimuli. Mens næste generations sekventeringsmetoder er begyndt at karakterisere genomiske placeringer for individuelle histonmodifikationer, kan kun en ændring undersøges samtidigt. I betragtning af at der er hundredvis af forskellige HPTM’er, har vi udviklet et kvantitativt mål med høj gennemstrømning af globale HPTM’er, der kan bruges til at screene histonmodifikationer, inden der udføres mere omfattende genomsekventeringsmetoder. Denne protokol beskriver en flowcytometribaseret metode til påvisning af globale HPTM’er og kan udføres ved hjælp af celler i kultur eller isolerede celler fra in vivo-væv . Vi præsenterer eksempeldata fra isoleret musehjernemikroglia for at demonstrere analysens følsomhed til at detektere globale skift i HPTM’er som reaktion på en bakterieafledt immunstimulus (lipopolysaccharid). Denne protokol muliggør hurtig og kvantitativ vurdering af HPTM’er og kan anvendes på enhver transkriptionel eller epigenetisk regulator, der kan detekteres af et antistof.
Epigenetik er studiet af de mekanismer, der regulerer genekspression uden at ændre den underliggende DNA-sekvens. Epigenetisk regulering af genekspression er dynamisk i celler og kan muliggøre hurtige og koordinerede reaktioner på forskellige miljømæssige stimuli. Den dynamiske regulering sker delvis på grund af ændringer i kromatinstrukturen på nukleosomniveauet, som består af histonproteiner (H2A, H2B, H3, H4) samlet i en oktamerkerne tæt viklet af DNA1. Interaktionerne mellem histonproteinerne og DNA’et kan kontrollere tilgængeligheden af DNA til transkriptionsmaskiner, som i sidste ende kan kontrollere genekspression og andre aspekter af kromatinbiologi2. Histonproteiner har ustrukturerede haler, som indeholder positivt ladede rester, der danner elektrostatiske interaktioner med den negativt ladede DNA-rygrad. Disse interaktioner resulterer i tæt pakning af DNA’et og reduceret DNA-tilgængelighed. Kovalente modifikationer af histonhalerne, kaldet histon posttranslationelle modifikationer (HPTM’er), kan regulere disse interaktioner 3,4. Nogle af de mest velkarakteriserede HPTM’er inkluderer histonhaleacetylering og methylering, som kan ændre affiniteten af elektrostatiske interaktioner mellem histonhalerne og DNA, hvilket resulterer i differentiel tilgængelighed til det underliggende DNA og rekruttering af transkriptionsfaktorer, der genkender disse HPTM’er på bestemte steder. HPTM’er reguleres af tre vigtige klasser af enzymer kaldet læsere – som genkender, forfattere – som deponerer og viskelædere – som fjerner HPTM’er. Således kan rekruttering eller opløsning af læser-, forfatter- eller viskelæderenzymer i sidste ende ændre landskabet for HPTM’er og styre kromatins struktur og funktion, hvilket gør deres regulering og aflæsning afgørende for forståelsen af cellulær biologi og funktion 3,4.
Cellerne i centralnervesystemet (CNS) er epigenetisk fleksible, da de ændrer deres transkriptom for at tilpasse sig miljømæssige stimuli. Akkumulerende beviser tyder på, at ændringer i epigenomet, såsom DNA-methylering, ikke-kodende RNA’er og HPTM’er, spiller en væsentlig rolle i hukommelsesdannelse og synaptisk funktion5. Forstyrrelse af HPTM-dynamik gennem manipulation af de relevante læsere, forfattere eller viskelædere kan blokere eller forbedre associativ læring og langsigtet potensering 6,7,8. Microglia, den residente immuncelle i CNS, regulerer hurtigt deres transkriptom som reaktion på immunstimulering gennem dynamiske ændringer i deres epigenom 9,10,11. Dette høje niveau af tilpasning til deres lokale hjernemiljø gør dem vanskelige at undersøge i en isoleret sammenhæng, da undersøgelser har vist, at epigenomet og transkriptomet af mikroglia ændres efter kun få timer i kulturmedier efter fjernelse fra hjernemiljøet11. Da mikroglia kun udgør 10% af hjernens celler, mangler målinger, der undersøger ændringer på hele vævsniveau, desuden følsomhed og specificitet12,13. Som følge heraf skal mikroglia hurtigt isoleres for at undersøge de epigenetiske ændringer såsom HPTM-niveauer, ex vivo.
De metoder, der almindeligvis anvendes til at undersøge HPTM’er, omfatter kromatin-immunudfældningssekventering (ChIP-seq) og spaltning under mål og tagmentationssekventering (CUT&Tag-seq)4. Selvom disse teknikker er meget specifikke for en individuel HPTM og kan informere tilstedeværelsen af HPTM’er inden for en specifik genomisk sammenhæng, kan de kun undersøge en af de mange mulige HPTM’er inden for et enkelt eksperiment11,14 Før man fortsætter med sådanne eksperimenter, som kræver en betydelig tids- og pengeinvestering, er det derfor meget værdifuldt at indsnævre listen over potentielt interessante HPTM’er til yderligere undersøgelse ved først at undersøge ændringer i globale niveauer af HPTM’er. De to vigtigste tilgange til undersøgelse af globale HPTM-niveauer er immunhistokemi og western blot-analyse, men begge tilgange er kun semikvantitative, lave gennemstrømninger og kræver et stort antal vævssektioner eller isolerede celler 15,16. Derfor sigtede vi mod at udvikle en meget følsom, kvantitativ metode, der kunne bruges til at undersøge de globale HPTM-niveauer hurtigt og på enkeltcelleniveau.
Den præsenterede protokol muliggør hurtig påvisning af globale HPTM-niveauer ved hjælp af intranukleær flowcytometri. Tidligere undersøgelser i kræftceller har retfærdiggjort vigtigheden af at undersøge globale niveauer fra et klinisk perspektiv 17,18. Det er også almindeligt, at undersøgelser bruger globale niveauer som screeningsmetode forud for vurdering af genomisk placering af specifikke HPTM’er af interesse19,20. For mikroglia er det udfordrende at vurdere globale niveauer efter isolering på grund af det lave celleudbytte; Pan et al præsenterer globale HPTM-niveauer fra isoleret mikroglia, hvor mikroglia fra tre dyr blev samlet for at muliggøre påvisning af proteinniveau ved western blot19. Ved hjælp af vores protokol er vi i stand til at registrere globale ændringer med meget lavere celleinput, hvilket muliggør screening af flere mærker pr. dyr og eliminerer behovet for at samle prøver.
Her beskriver vi en protokol til hurtig detektering af HPTM-niveauer via kvantitativ intranukleær flowcytometri i isoleret mikroglia. Mens vi fokuserer specifikt på HPTM-kvantificering for korthedens skyld, kan denne protokol bruges på samme måde til at kvantificere globale niveauer af læser-, forfatter- og viskelæderenzymer. Protokollen leveres i to dele: for det første isolationsmetoden for microglia og for det andet den flowcytometribaserede metode til bestemmelse af HPTM-niveauer. Isolationsmetoden giver celler, der kan bruges til både RNA-isolering og HPTM-niveauvurdering, hvilket muliggør evaluering af genekspression og HPTM-niveauer fra den samme prøve. Derudover kan metoden til HPTM-vurdering anvendes på andre celletyper som angivet i protokollen.
Den præsenterede protokol muliggør kvantitativ vurdering af globale HPTM-niveauer gennem flowcytometri. Mens denne protokol præsenterer en ny metode, har tidligere undersøgelser foretaget kvantitativ vurdering af proteiner ved hjælp af en lignende tilgang26. Tidligere metoder, der anvendes til at vurdere globale niveauer af HPTM’er, omfatter immunhistokemi og western blot 16,17,19,20. Den fremlagte flowcytometribaserede metode er en let kvantificerbar metode, mens western blot og immunhistokemi er semikvantitative og har lavere gennemstrømning. Western blot er afhængig af cellelyse og kræver således både proteinnormalisering og et belastningskontrolprotein, der antages at være uændret ved den eksperimentelle tilstand27. Immunhistokemi er semikvantitativ og meget lav gennemstrømning, da det er vanskeligt kvantitativt at vurdere mængden af protein uden at undersøge på et enkelt celleniveau16. På samme måde er der for den isolerede mikroglia en fordel ved at bruge flowcytometrimetoden på grund af det begrænsede udbytte, da western blot kræver meget større proteininput19. De lave cellenummerkrav gør det muligt at køre flere farvningspaneler fra det samme dyr.
Som med enhver anden metode er der imidlertid begrænsninger for denne teknik, herunder antistofomkostninger og tilgængelighed, da ikke alle antistoffer fungerer godt i en flowcytometriindstilling. Derudover er koncentrationen af det krævede antistof sammenlignet med immunoblot meget højere. Mens multiplexing gør det muligt at anvende flere antistoffer på det samme panel af celler, kan celler ikke fjernes fra antistoffet efter analyse, hvilket begrænser celleforbruget til en pr. Antistofart. Dette adskiller sig fra immunoblot, hvor den samme plet kan anvendes gentagne gange. Afhængigt af tilgængeligheden af antistoffer og antallet af detektionskanaler på et cytometer ville det imidlertid være muligt at undersøge op til et dusin mærker samtidigt.
Den nuværende metode fanger kun globale niveauer af proteinekspression og ikke den specifikke genomiske placering, og ændringer i globale niveauer afspejler muligvis ikke ændringer på individuelle genomiske loci. På samme måde betyder manglende ændring i globale niveauer muligvis ikke, at ingen genomiske loci undergår ændringer, blot at de globale ændringer summerer til ingen forskelle mellem behandlinger. Som sådan er denne teknik beregnet til at blive brugt som en skærm til at identificere HPTM’er af interesse for genomisk analyse. Desuden giver denne metode ikke mulighed for sammenligning på tværs af forskellige proteinmærker, undtagen når den vurderes som en foldændring til kontrol. Derfor er dette begrænset sammenlignet med en standardkurvebaseret metode som ELISA til proteinbestemmelse.
Den præsenterede protokol tilbyder en strategi til isolering af levende hjernemikroglia. Denne protokol er afhængig af P2RY12-proteinekspression til mikrogliaisolering. P2RY12 er imidlertid en homeostatisk markør i mikroglia og kan nedreguleres i sygdomsmodeller, såsom 5XFAD22. Når du bruger et sygdomsmodeldyr, skal du derfor sørge for at vælge andre markørproteiner såsom TMEM119, CD11b eller CD45 for at hjælpe med isolering af microglia23. På samme måde præsenterer vi denne protokol som isolering fra hippocampus og / eller cortex. Denne protokol ville arbejde for at isolere mikroglia fra andre hjerneområder, herunder hvide substansområder, men flere dyr kan være nødvendige for at få nok mikroglia afhængigt af størrelsen af de interessante regioner.
Den præsenterede protokol kan robust isolere levende hjernemikroglia, men der er flere trin, beskrevet nedenfor, i isolationsfasen, der kan reducere celleudbyttet, hvis det udføres forkert.
Perfusioner for denne protokol resulterer i en højere procentdel af mikroglia i det immunberigede fragment, hvilket vil reducere mængden af tid ved sorteringen. Perfusion er dog ikke påkrævet, og andre metoder til eutanasi kan anvendes, hvis det kræves.
Under mikrogliaisolering skal myelin fjernes fuldstændigt. Flowcytometre er afhængige af, at celler er i stand til at rejse gennem smalle slanger i et hurtigt tempo. På grund af sin viskositet og tendens til klumpning forårsager myelin problemer med cytometre, hvilket ofte forårsager tilstopninger, som både kan beskadige udstyret og ødelægge prøven, hvilket reducerer udbyttet drastisk. Vær forsigtig med at fjerne al myelin under indsamling af immunberigede fragmenter for at undgå problemer nedstrøms.
Pladefarvning versus rørfarvning: I denne protokol beskrev vi to muligheder for farvning af celler i enten 1,5 ml rør eller en 96 brøndplade. Brugssagen for hver afhænger af eksperimentet; Generelt er rørfarvning dog lavere risiko for at påvirke udbyttet end pladefarvning, da svirp risikerer tab af celler, hvis det gøres forkert. Pladefarvning er meget hurtigere, da det er tidskrævende at opsuge supernatanten for hvert rør. Før fiksering (til sortering osv.) Brug rørfarvning for at maksimere udbyttet og reducere risikoen for tab. Til HPTM-analyse, når cellerne er fastgjort til intranuklear farvning, er pelleten imidlertid mere stabil, og der er reduceret risiko for tab ved svipning.
Etablering af den diskontinuerlige densitetsgradient: Ved etablering af lagdelingen er det vigtigt at opsætte lagene korrekt for at opnå den immunberigede fraktion. Hvis lagene forstyrres eller blandes og virker uklare, vil cellerne ikke sortere til deres ønskede placering, og der vil være vanskeligheder med at opnå den immunberigede cellefraktion. Hvis dette sker, centrifugeres med densitetsmediet for at fjerne myelin og derefter samle alle de resterende fraktioner, fortyndes med 3 ml FACS-buffer til 1 ml densitetsmedium og blandes godt (dette kræver flere rør). Drej ved 500 x g i 10 min med bremsen på 0. Supernatanten kasseres, og der er kun ~300 μL opløsning tilbage. Saml hele prøven og pletten. Dette vil give reducerede sorteringsprocenter og en højere mængde tid brugt ved cytometeret, men udbyttet kan stadig være sammenligneligt.
Ved anvendelse af isolationsmetoden er det fordelagtigt at kunne indsamle celler til RNA og til HPTM-evaluering fra samme musehjerne. I denne situation kan celler efter sortering af den levende mikroglia opdeles for at allokere en del til RNA-evaluering (minimum inputantal celler for at opnå et anstændigt RNA-udbytte er 75.000 celler) og en del til yderligere flowcytometrianalyse (minimum 10.000 celler pr. Brønd for god bestemmelse af MFI). I dette tilfælde kræves flowcytometersortering. Men når man kun planlægger at bruge cellerne til HPTM-analyse, er sortering ikke påkrævet, og immunfraktionen kan farves med P2RY12-antistoffet og HPTM-antistoffet. Gating på cytometeret kan derefter indstilles til P2RY12+ microglia, som det ville blive gjort for flowsortering, for kun at analysere HPTM-signal inden for microglia. Eliminering af sorteringen gør det muligt for protokollen at være hurtigere og mere omkostningseffektiv. Hvis HPTM’er evalueres fra dyrkede celler, er det desuden tilstrækkeligt at starte ved farvningsprotokollen, og der kræves ingen cellemarkørantistoffer som vist i figur 6. HPTM-evalueringsprotokollen kan bruges til mange celletyper, herunder dyrkede, primære og IPSC-afledte celler.
Endelig, mens vi kun har præsenteret to potentielle anvendelser af mikroglia nedstrøms for isolation, er der mange andre, herunder epigenetiske teknikker som ChIP, CUT & Tag og CUT &RUN. I tilfælde af genomiske epigenetiske teknikker, hvor karakterisering af ændringer på specifikke loci er af interesse, skal du vælge specifikke hæmmere til forfattere og viskelædere af kromatinmærker11 , der er skræddersyet til eksperimenterne for at sikre, at eventuelle mikrogliale epigenetiske modifikationer, der er profileret, ikke er tekniske artefakter fra nogen trin i isolationsproceduren, såsom enzymatisk fordøjelse. Ved vurdering af ændringer i globale niveauer af epigenetiske mærker, såsom ved anvendelse af kvantitativ flowcytometri, forventes eventuelle procedureinducerede ændringer ikke at være så store, at de detekteres på globalt plan.
Samlet set giver de diskuterede metoder en ny, enkeltcellemetode til kvantificering af globale niveauer af histonmodifikationer og andre epigenetiske ændringer ved flowcytometri. Vi demonstrerede, at denne metode er tilstrækkelig følsom til at detektere globale ændringer i forstærkermarkøren H3K27ac i mikroglia som reaktion på LPS in vivo. Dette er i overensstemmelse med tidligere ChIP-sekventering af H3K27ac efter LPS-stimulering, der viser dramatisk ombygning af forstærkere, der reagerer på LPS28. Anvendelse af denne metode vil muliggøre undersøgelse af globale epigenetiske ændringer på tværs af forskellige hjernecelletyper i udvikling og sygdom.
The authors have nothing to disclose.
Tak til Yanyang Bai for at hjælpe med immunoblottet i figur 5. Dette arbejde blev støttet af Canadian Institutes for Health Research [CRC-RS 950-232402 til AC]; Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 til AC]; Scottish Rite Charitable Foundation [21103 til AC] og Brain Canada Foundation [AWD-023132 til AC]; University of British Columbia Aboriginal Graduate Fellowship (6481 til MT); British Columbia Graduate Scholarship (6768 til MT); Canadian Open Neuroscience Platform Student Scholar Award (10901 til JK); University of British Columbia fireårigt ph.d.-stipendium (6569 til JK). Bidragyderne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om udgivelse eller udarbejdelse af manuskriptet.
0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
15 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Falcon | 352196 | |
24-well Clear Not Treated Plates | Costar | 3738 | |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
96 Well Clear Polystyrene Microplate, clear round bottom, non treated surface | Corning | 3788 | |
Acetyl Histone 3 K9 (C5B11) | Cell Signalling Technology | 9649S | Dilution: 1:100 |
Acetyl Histone H4 K8 (2594) | Cell Signalling Technology | 2594S | Dilution: 1:100 |
Acetyl-Histone H3 K27 (D5E4) | Cell Signalling Technology | 8173S | Dilution: 1:100 |
Acetyl-Histone H3 Lys27 (MA523516) | Invitrogen | MA523516 | Dilution: 1:100 |
Actinomycin D | New England Biolabs | 15021S | |
Anisomycin | New England Biolabs | 2222S | |
Anti-Histone H3 (tri methyl K4) | Abcam | ab213224 | Dilution: 1:100 |
Anti-Lactyl-Histone H4 (Lys 12) Rabbit mAb | PTM Biolabs | PTM-1411RM | Dilution: 1:250 |
Anti-L-Lactyllysine Rabbit pAb | PRM Biolabs | PTM-1401RM | Dilution: 1:250 |
Apc anti-P2RY12 Antibody, Clone: S16007D | BioLegend | 848006 | |
BSA | Tocris | 5217 | |
Cyto-Last Buffer | BioLegend | 422501 | |
dimethylsulfoxide, sterile | Cell Signalling Technology | 12611S | |
DNAse I | STEMCELL Technologies | 07900 | |
Donkey Anti Mouse AlexaFluor488 | Jackson ImmunoResearch | 715-546-150 | Dilution: 1:500 |
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor488 | ABclonal | AS035 | Dilution: 1:500 |
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568 | Invitrogen | A10042 | Dilution: 1:500 |
Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421 | BioLegend | 406410 | Dilution: 1:500 |
Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
Fisherbrand Disposable PES Filter Unit, 250mL | Fisherbrand | FB12566502 | |
H3K18ac Polyclonal Antibody | Invitrogen | 720095 | Dilution: 1:100 |
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14185052 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175103 | |
Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002) | Abcam | ab6002 | Dilution: 1:100 |
KONTES Dounce Tissue Grinders 125mm 7mL | VWR | 885300-0007 | |
Lactyl-Histone H3 (Lys 18) Rabbit mAb | PTM BIolabs | PTM-1406RM | Dilution: 1:250 |
Lipopolysacharide | Sigma-Aldrich | L5418 | |
Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
OneComp eBeads Compensation Beads | Invitrogen | 01-1111-41 | |
PDS Kit, Papain Vial – Worthington Biochemical | Cedarlane | LK003178 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | GE17-0891-02 | |
Phenol Red | VWR | RC57004 | |
QIAshredder | Qiagen | 79656 | |
Rainbow Fluorescent Particles, 1 peak (3.0-3.4 uM – Mid Range Intensity | BioLegend | 422905 | |
RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Invitrogen | AM12400 | |
Rneasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
Round Bottom Polypropylene Tubes with Caps, 5 mL | Corning | 352063 | |
Triptolide | New England Biolabs | 97539 | |
True Nuclear Transcription Factor Buffer Set | BioLegend | 424401 | |
TruStain FcX PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | BioLegend | 156604 | |
Trypan Blue | VWR | 97063-702 | |
Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 |