Optisches Dual-Dye-Mapping von Herzen aus RyR2R2474S Knock-In-Mäusen mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie
Summary
Dieses Protokoll führt eine optische Dual-Dye-Kartierung von Mausherzen ein, die von Wildtyp- und Knock-in-Tieren mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie betroffen sind, einschließlich elektrophysiologischer Messungen der Transmembranspannung und intrazellulärerCa2+ -Transienten mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.
Abstract
Die pro-arrhythmische Herzerkrankung katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie (CPVT) manifestiert sich als polymorphe ventrikuläre Tachykardie-Episoden nach körperlicher Aktivität, Stress oder Katecholamin-Provokation, die sich zu potenziell tödlichem Kammerflimmern verschlechtern können. Das Mäuseherz ist eine weit verbreitete Spezies zur Modellierung von erblichen Herzrhythmusstörungen, einschließlich CPVT. Die gleichzeitige optische Kartierung des Transmembranpotentials (Vm) und der Kalziumtransienten (CaT) aus Langendorff-perfundierten Mäuseherzen hat das Potenzial, die Mechanismen aufzuklären, die der Arrhythmogenese zugrunde liegen. Im Vergleich zur Untersuchung auf zellulärer Ebene kann die optische Mapping-Technik einige elektrophysiologische Parameter testen, wie z. B. die Bestimmung der Aktivierung, der Leitungsgeschwindigkeit, der Aktionspotentialdauer und der CaT-Dauer. In diesem Artikel werden der Aufbau der Instrumentierung und das experimentelle Verfahren für die optische Kartierung von CaT und Vm in murinen Wildtyp- und heterozygoten RyR2-R2474S/+-Herzen vorgestellt, kombiniert mit programmierter elektrischer Stimulation vor und während der Isoproterenol-Challenge. Dieser Ansatz hat eine praktikable und zuverlässige Methode zur mechanistischen Untersuchung der CPVT-Erkrankung in einem ex vivo Mausherzpräparat gezeigt.
Introduction
Die katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie (CPVT) manifestiert sich als Episoden einer polymorphen ventrikulären Tachykardie (PVT) nach körperlicher Aktivität, Stress oder Katecholaminbelastung, die sich zu einem potenziell tödlichen Kammerflimmern verschlechtern kann 1,2,3,4 . Neuere Hinweise nach dem ersten Bericht als klinisches Syndrom im Jahr 1995 implizierten Mutationen in sieben Genen, die alle an der Freisetzung von Ca 2+ durch sarkoplasmatische retikuläre (SR) Speichern beteiligt sind: die am häufigsten berichteten RYR2-kodierenden Ryanodinrezeptor 2 (RyR2) der Ca2+-Freisetzungskanäle5,6, FKBP12.67, CASQ2, die für kardiales Calsequestrin8 kodieren, TRDN kodiert für das junktionale SR-Protein Triadin 9 und CALM1 9, CALM2 10 und CALM3, die identisch für Calmodulin11,12 kodieren. Diese genotypischen Muster führen die arrhythmischen Ereignisse auf die unregulierte pathologische Freisetzung des SR-Speichers Ca2+12 zurück.
Die spontane Freisetzung von Ca 2+ aus SR kann als Ca 2+ Funken oder Ca 2+ Wellen nachgewiesen werden, wodurch der Na+/Ca 2+ Austauscher (NCX) aktiviert wird. Der Wärmetauscher von einem Ca2+ für drei Na+ erzeugt einen nach innen gerichteten Strom, der die diastolische Depolarisation beschleunigt und die Membranspannung an die Schwelle des Aktionspotentials (AP) treibt. In RyR2-Knock-in-Mäusen führt die erhöhte Aktivität von RyR2R4496C im Sinusknoten (SAN) zu einer unerwarteten Abnahme der SAN-Automatik durch Ca2+-abhängige Abnahme der ICa,L– und SRCa2+-Depletion während der Diastole, wodurch subzelluläre pathophysiologische Veränderungen identifiziert werden, die zur SAN-Dysfunktion bei CPVT-Patienten beitragen13,14. Das Auftreten der verwandten zytosolischenCa2+-Wellen von Kardiomyozyten ist wahrscheinlicher, wenn die zytosolische [Ca2+] im Hintergrund nach einer RyR-Sensibilisierung durch Katecholamin, einschließlich Isoproterenol (ISO), erhöht wird.
Detaillierte kinetische Veränderungen in der Ca 2+ Signalübertragung nach RyR2-vermittelter Ca2+ Freisetzung als Reaktion auf die Aktivierung des Aktionspotentials (AP), die die Ursache für die beobachteten ventrikulären Arrhythmien in intakten kardialen CPVT-Modellen sein könnten, müssen noch für das gesamte Spektrum der berichteten RyR2-Genotypen bestimmtwerden 12. In diesem Artikel werden der Aufbau und die experimentelle Vorgehensweise für die Hochdurchsatzkartierung von Ca2+ Signalen und Transmembranpotentialen (Vm) in murinen Wildtyp- (WT) und heterozygoten RyR2-R2474S/+ Herzen vorgestellt, kombiniert mit programmierter elektrischer Stimulation vor und nach Isoproterenol-Provokation. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur mechanistischen Untersuchung der CPVT-Erkrankung in isolierten Mäuseherzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Basierend auf unserer Erfahrung sind die Schlüssel zu einer erfolgreichen optischen Dual-Dye-Kartierung eines Mausherzens eine gut vorbereitete Lösung und ein gut vorbereitetes Herz, die Farbstoffbeladung, das Erreichen des besten Signal-Rausch-Verhältnisses und die Reduzierung des Bewegungsartefakts.
Herstellung der Lösung
Die Krebslösung ist für ein erfolgreiches Herzexperiment unerlässlich. MgCl2- undCaCl2-Stammlösungen (1 mol/L) werden im Voraus unter…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wird von der National Natural Science Foundation of China (81700308 zu XO und 31871181 zu ML und 82270334 zu XT), dem Sichuan Province Science and Technology Support Program (CN) (2021YJ0206 bis XO, 23ZYZYTS0433 und 2022YFS0607 bis XT und 2022NSFSC1602 bis TC) und dem State Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 bis XO) unterstützt. MRC (G10031871181 bis ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE in Oxford (ML) Stipendien.
Materials
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
Referências
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