Denne protokollen introduserer dual-dye optisk kartlegging av musehjerter oppnådd fra villtype og knock-in dyr påvirket av katekolaminerg polymorf ventrikulær takykardi, inkludert elektrofysiologiske målinger av transmembranspenning og intracellulære Ca2+ transienter med høy temporal og romlig oppløsning.
Den proarytmiske hjerteforstyrrelsen katekolaminerg polymorf ventrikkeltakykardi (CPVT) manifesterer seg som polymorfe ventrikulære takykardiepisoder etter fysisk aktivitet, stress eller katekolaminutfordring, som kan forverres til potensielt dødelig ventrikkelflimmer. Musehjertet er en utbredt art for modellering av arvelige hjertearytmiske sykdommer, inkludert CPVT. Samtidig optisk kartlegging av transmembranpotensiale (Vm) og kalsiumtransienter (CaT) fra Langendorff-perfuserte musehjerter har potensial til å belyse mekanismer som ligger til grunn for arytmogenesen. Sammenlignet med undersøkelsen på cellenivå kan den optiske kartleggingsteknikken teste noen elektrofysiologiske parametere, for eksempel bestemmelse av aktivering, ledningshastighet, aksjonspotensiell varighet og CaT-varighet. Denne artikkelen presenterer instrumenteringsoppsett og eksperimentell prosedyre for optisk kartlegging av CaT og Vm i villtype og heterozygot RyR2-R2474S/+ hjerter, kombinert med programmert elektrisk pacing før og under isoproterenolutfordringen. Denne tilnærmingen har vist en gjennomførbar og pålitelig metode for mekanistisk å studere CPVT-sykdom i en ex vivo musehjertepreparasjon.
Arvelig hjertesykdom katekolaminerg polymorf ventrikkeltakykardi (CPVT) manifesterer seg som polymorf ventrikulær takykardi (PVT) episoder etter fysisk aktivitet, stress eller katekolaminutfordring, som kan forverres til potensielt dødelig ventrikkelflimmer 1,2,3,4 . Nyere bevis etter sin første rapport som et klinisk syndrom i 1995 impliserte mutasjoner i syv gener, alle involvert i sarkoplasmatisk retikulær (SR) lagre Ca 2 + utgivelse i denne tilstanden: den hyppigst rapporterte RYR2 koding ryanodin reseptor 2 (RyR2) av Ca2 + utgivelseskanaler5,6, FKBP12.67, CASQ2 koding hjerte calsequestrin8, TRDN koding av det kryssende SR-proteinet triadin 9, og CALM1 9, CALM2 10 og CALM3 identisk kodende calmodulin11,12. Disse genotypiske mønstrene tilskriver de arytmiske hendelsene den uregulerte patologiske frigjøringen av SR-lager Ca2+12.
Spontan Ca 2+-frigjøring fra SR kan detekteres som Ca 2+ gnister eller Ca 2+ bølger, som aktiverer Na+/Ca 2+ veksleren (NCX). Veksleren til en Ca2 + for tre Na + genererer en innadgående strøm, noe som øker den diastoliske depolariseringen og driver membranspenningen til terskelen for handlingspotensial (AP). I RyR2-innslagsmus fører den økte aktiviteten til RyR2R4496C i sinoatrialknuten (SAN) til en uventet reduksjon i SAN-automatikk ved Ca 2+-avhengig reduksjon av I Ca,L og SR Ca2+-uttømming under diastol, identifisering av subcellulære patofysiologiske endringer som bidrar til SAN-dysfunksjon hos CPVT-pasienter 13,14. Forekomst av de relaterte kardiomyocytt-cytosoliske Ca 2+-bølgene er mer sannsynlig etter økning i bakgrunnscytosolisk [Ca2+] etter RyR-sensibilisering av katekolamin, inkludert isoproterenol (ISO), utfordring.
Detaljerte kinetiske endringer i Ca 2+-signalering etter RyR2-mediert Ca2+-frigjøring som respons på aktivering av aksjonspotensial (AP) som kan være årsaken til de observerte ventrikulære arytmiene i intakte hjerte-CPVT-modeller, gjenstår å bestemme for hele spekteret av rapporterte RyR2-genotyper12. Denne artikkelen presenterer instrumenteringsoppsett og eksperimentell prosedyre for kartlegging av høy gjennomstrømning av Ca2+ signaler og transmembrane potensialer (Vm) i murine wild-type (WT) og heterozygot RyR2-R2474S/+ hjerter, kombinert med programmert elektrisk pacing før og etter isoproterenol utfordring. Denne protokollen gir en metode for den mekanistiske studien av CPVT-sykdom i isolerte musehjerter.
Basert på vår erfaring inkluderer nøklene til en vellykket dobbelfarget optisk kartlegging av et musehjerte en godt forberedt løsning og hjerte-, fargestoffbelastning, oppnå det beste signal-støy-forholdet og redusere bevegelsesartefakten.
Fremstilling av oppløsning
Krebs løsning er viktig for et vellykket hjerteeksperiment. MgCl2 ogCaCl2 stamløsninger (1 mol / L) fremstilles på forhånd med tanke på vannabsorpsjon og tilsettes til Krebs-lø…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien støttes av National Natural Science Foundation of China (81700308 til XO og 31871181 til ML, og 82270334 til XT), Sichuan Province Science and Technology Support Program (CN) (2021YJ0206 til XO, 23ZYZYTS0433 og 2022YFS0607 til XT, og 2022NSFSC1602 til TC) og State Key Laboratory for kjemi og molekylærteknikk av medisinske ressurser (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 til XO), MRC (G10031871181 til ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE ved Oxford (ML) tilskudd.
0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |