Dual-Dye optisk kartläggning av hjärtan från RyR2R2474S Knock-In möss av katekolaminerg polymorf ventrikulär takykardi
Summary
Detta protokoll introducerar optisk kartläggning av mushjärtan med dubbla färgämnen erhållna från vildtyps- och knock-in-djur som drabbats av katekolaminerg polymorf ventrikulär takykardi, inklusive elektrofysiologiska mätningar av transmembranspänning och intracellulära Ca2+ -transienter med hög tidsmässig och rumslig upplösning.
Abstract
Den proarytmiska hjärtsjukdomen katekolaminerg polymorf ventrikulär takykardi (CPVT) manifesterar sig som polymorfa ventrikulära takykardiepisoder efter fysisk aktivitet, stress eller katekolaminprovokation, som kan försämras till potentiellt dödligt ventrikelflimmer. Mushjärtat är en utbredd art för modellering av ärftliga hjärtarytmisjukdomar, inklusive CPVT. Samtidig optisk kartläggning av transmembranpotential (Vm) och kalciumtransienter (CaT) från Langendorff-perfunderade mushjärtan har potential att belysa mekanismer som ligger till grund för arytmogenes. Jämfört med undersökningen på cellnivå kan den optiska kartläggningstekniken testa vissa elektrofysiologiska parametrar, såsom bestämning av aktivering, ledningshastighet, aktionspotentialvaraktighet och CaT-varaktighet. Denna artikel presenterar instrumenteringsuppställningen och den experimentella proceduren för optisk kartläggning av CaT och Vm med hög genomströmning i murina vildtyps- och heterozygota RyR2-R2474S/+-hjärtan, kombinerat med programmerad elektrisk stimulering före och under isoprotereno-provokationen. Detta tillvägagångssätt har visat sig vara en genomförbar och tillförlitlig metod för mekanistisk studie av CPVT-sjukdom i ett ex vivo-hjärtpreparat för mus.
Introduction
Ärftlig hjärtsjukdom katekolaminerg polymorf ventrikulär takykardi (CPVT) yttrar sig som polymorf ventrikulär takykardi (PVT) efter fysisk aktivitet, stress eller katekolaminprovokation, som kan försämras till potentiellt dödligt ventrikelflimmer 1,2,3,4 . Nya bevis efter den första rapporten som ett kliniskt syndrom 1995 implicerade mutationer i sju gener, alla involverade i sarkoplasmatisk retikulär (SR) lagrar Ca 2+-frisättning i detta tillstånd: den mest frekvent rapporterade RYR2-kodande ryanodinreceptorn 2 (RyR2) i Ca2+ frisättningskanalerna5,6, FKBP12.67, CASQ2 som kodar för hjärtkalsekvestrin8, TRDN som kodar för det korsande SR-proteinet triadin 9 och CALM1 9, CALM2 10 och CALM3 kodar identiskt för kalmodulin11,12. Dessa genotypiska mönster tillskriver de arytmiska händelserna till den oreglerade patologiska frisättningen av SR store Ca2 + 12.
Spontan Ca 2+-frisättning från SR kan detekteras som Ca 2+-gnistor eller Ca 2+-vågor, vilket aktiverar Na+/Ca 2+–växlaren (NCX). Växlaren av en Ca2+ för tre Na+ genererar en inåtgående ström, vilket påskyndar den diastoliska depolarisationen och driver membranspänningen till tröskeln för aktionspotential (AP). I RyR2 knock-in-möss leder den ökade aktiviteten av RyR2R4496C i sinusknutan (SAN) till en oväntad minskning av SAN-automaticiteten genom Ca 2+-beroende minskning av ICa,L och SR Ca2+ utarmning under diastole, vilket identifierar subcellulära patofysiologiska förändringar som bidrar till SAN-dysfunktionen hos CPVT-patienter13,14. Förekomst av de besläktade kardiomyocytcytosoliska Ca 2+-vågorna är mer sannolik efter ökningar av cytosoliska bakgrundsvågor [Ca2+] efter RyR-sensibilisering med katekolamin, inklusive isoproterenol (ISO), provokation.
Detaljerade kinetiska förändringar i Ca 2+-signalering efter RyR2-medierad Ca2+-frisättning som svar på aktivering av aktionspotential (AP) som kan vara orsaken till de observerade ventrikulära arytmierna i intakta hjärt-CPVT-modeller återstår att bestämma för hela skalan av rapporterade RyR2-genotyper12. Denna artikel presenterar instrumenteringsuppställningen och den experimentella proceduren för kartläggning av Ca2+-signaler och transmembranpotentialer (Vm) i murina vildtyps- (WT) och heterozygota RyR2-R2474S/+-hjärtan, kombinerat med programmerad elektrisk stimulering före och efter isoproterenolackprovokation. Detta protokoll tillhandahåller en metod för mekanistisk studie av CPVT-sjukdom i isolerade mushjärtan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Baserat på vår erfarenhet inkluderar nycklarna till en framgångsrik optisk kartläggning av ett mushjärta med dubbla färgämnen en väl förberedd lösning och hjärta, färgladdning, att uppnå det bästa signal-brusförhållandet och att minska rörelseartefakten.
Beredning av lösning
Krebs lösning är avgörande för ett lyckat hjärtexperiment. MgCl 2 och CaCl 2 stamlösningar (1 mol/L) bereds i förväg med tanke på deras vattenabsorption och tillsä…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöds av National Natural Science Foundation of China (81700308 till XO och 31871181 till ML, och 82270334 till XT), Sichuan-provinsens vetenskaps- och teknikstödprogram (CN) (2021YJ0206 till XO, 23ZYZYTS0433 och 2022YFS0607 till XT och 2022NSFSC1602 till TC) och State Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 till XO), MRC (G10031871181 till ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE i Oxford (ML) bidrag.
Materials
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
Referências
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
- Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).
- Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).
- Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
- Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
- Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., Adam, M. P., et al. CACNA1C-related disorders. GeneReviews. , (1993).
- Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
- Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
- Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
- Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
- Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
- O’Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
- O’Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
- Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).
- Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
- Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
- Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- O’Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
- He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).
- Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
- Mal Baudot, ., et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).
- Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
- Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
- Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
- Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).
- He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).
- Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
- Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).
