Neste protocolo, descrevemos os procedimentos técnicos para gerar camundongos knockout específicos para tecido adiposo marrom (BAT) utilizando um sistema combinado de RNA guia único (sgRNA) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e vírus adenoassociado (AAV). As etapas descritas incluem o planejamento dos sgRNAs, a preparação das partículas de AAV-sgRNA e a microinjeção de AAV nos lóbulos BAT.
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Artigo de método
Geração de camundongos knockout específicos para gordura marrom usando um sistema combinado de RNA guia único Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e vírus adenoassociado
Neste artigo
Resumo
Resumo
O tecido adiposo marrom (BAT) é um depósito adiposo especializado em dissipação de energia que também pode servir como órgão endócrino através da secreção de moléculas bioativas. A criação de camundongos knockout específicos para MTD é uma das abordagens mais populares para entender a contribuição de um gene de interesse para a regulação de energia mediada por BAT. A estratégia convencional de direcionamento gênico utilizando o sistema Cre-LoxP tem sido a principal abordagem para gerar camundongos knockout tecido-específicos. No entanto, essa abordagem é demorada e tediosa. Aqui, descrevemos um protocolo para o knockout rápido e eficiente de um gene de interesse em MTD usando um sistema combinado de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e RNA guia único (sgRNA) de vírus adenoassociado (AAV). A MTD interescapular está localizada na camada profunda entre os músculos. Assim, as MTD devem ser expostas para injetar o VAT de forma precisa e direta nas MTD dentro do campo visual. O manuseio cirúrgico adequado é crucial para evitar danos aos nervos e vasos simpáticos, como a veia de Sultzer que se conecta à BAT. Para minimizar o dano tecidual, há uma necessidade crítica de entender a localização anatômica tridimensional da MTD e as habilidades cirúrgicas necessárias nas etapas técnicas. Este protocolo destaca os principais procedimentos técnicos, incluindo o projeto de sgRNAs visando o gene de interesse, a preparação de partículas de AAV-sgRNA e a cirurgia para a microinjeção direta de AAV em ambos os lobos BAT para gerar camundongos knockout específicos para BAT, que podem ser amplamente aplicados para estudar as funções biológicas de genes em BAT.
Introdução
A obesidade está aumentando a uma taxa significativa em todo o mundo, levando a um amplo espectro de doenças metabólicas 1,2,3. O tecido adiposo é fundamental para essas patologias. Os dois tipos funcionalmente distintos de tecido adiposo que existem são o tecido adiposo branco (TAB), que armazena calorias em excesso, e o tecido adiposo marrom (BAT) e sua gordura bege/brite relacionada, que dissipam energia para a termogênese. Embora a MTD tenha sido reconhecida por sua função dissipadora de energia, ela também tem funções endócrinas por meio da produção de moléculas....
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Protocolo
Todos os experimentos e cuidados com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Joslin Diabetes Center.
1. Triagem de sgRNAs efetivos em células cultivadas
NOTA: Para tornar o ensaio custo-efetivo, antes de empacotar os sgRNAs em partículas de AAV, recomendamos testar diferentes sgRNAs em células cultivadas por meio de um sistema baseado em lentivírus para expressão de Cas9/sgRNA (Figura 1) e selecionar os sgRNAs que fornecem a maior eficiência de knockdown para experimentos in vivo .
- CRISPR-Cas9 sgRN....
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Resultados
Ao longo dos procedimentos acima, a entrega precisa do AAV-sgRNA para o BAT é crucial para o sucesso do protocolo. Para maximizar o efeito do AAV-sgRNA e minimizar o dano tecidual durante a cirurgia, é essencial entender a localização anatômica tridimensional (3D) da BAT. Como mostrado na Figura 3E, é difícil identificar a localização precisa da MTD sem expor o tecido. No entanto, o excesso de exposição às MTD pode danificar o tecido (Figura 3H, I
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Discussão
Os métodos publicados existentes para a entrega de genes mediados por AAV para a MTD interescapular não contêm fotos e vídeos detalhados descrevendo as técnicas cirúrgicas e a abordagem para a injeção direta de AAV na BAT. Na maioria dos métodos publicados33,34, o AAV é injetado nos tecidos adiposos ao redor da MTD interescapular em vez da MTD propriamente dita. Assim, existem várias etapas fundamentais nesse protocolo que determinam o sucesso do estudo. Estes in.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado em parte pelos subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (NIH) R01DK122808, R01DK102898 e R01DK132469 (para Y.-H.T.), bem como P30DK036836 (para o Centro de Pesquisa em Diabetes do Joslin Diabetes Center). T. T. foi apoiado pela SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Scholarship, Sunstar Foundation, Japão) e pela American Heart Association grant 903968. Y. Z. foi apoiado pela Charles A. King Trust Fellowship. Agradecemos a Sean D. Kodani pela gentileza de revisar o manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Produtos Químicos, Peptídeos e Proteínas | |||
| OPTI-MEM meio isento de soro | Invitrogen | 31985 | |
| Reagente de Infecção / Transfecção Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Reagente de Transfecção | Mirus | MIR 2300 | |
| DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vetor | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G plasmídeo de envelope | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 plasmídeo de embalagem | Addgene | 12260 | |
| Modelos experimentais: Linhas | |||
| Células HEK-293 Células | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 | Desenvolvido no laboratório Tseng | PMID: 14966273 | |
| Modelos Experimentais: Organismos/Cepas | |||
| Cas9 camundongos knockin | Jackson Laboratories | 24857 | |
| camundongos Ucp1-CRE | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Outros | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton seringa | Hamilton | Modelo 710 RN Seringa | |
| Solução de peróxido de hidrogênio Fisher | Scientific | H325-500 | |
| Agulha | Hamilton | 32 gauge, agulha RN de cubo pequeno, estilo de ponta de agulha 2 | |
| Sutura 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 polegadas Monofilamento 12/Bx | Henry Schein | ||
| Sutura 5-0 Unify Silk P-3 Preto 18 polegadas 12/Bx | Henry Schein |
Referências
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S.
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Reimpressões e permissões
