植物における2,4-ジブロモフェノールの代謝を解明
Summary
本プロトコルは、植物中の2,4−ジブロモフェノール代謝産物を同定するための簡単で効率的な方法を記載する。
Abstract
土壌は環境に廃棄される汚染物質の主要な吸収源であるため、作物は有機汚染物質に広くさらされる可能性があります。これは、汚染物質が蓄積した食品の消費を通じて潜在的な人間の曝露を生み出します。作物における生体異物の取り込みと代謝を解明することは、ヒトの食事曝露リスクの評価に不可欠です。ただし、このような実験では、無傷の植物を使用するには、さまざまな要因の影響を受ける可能性のある長期の実験と複雑なサンプル調製プロトコルが必要です。高分解能質量分析(HRMS)と組み合わせた植物カルス培養は、微生物または真菌の微小環境からの干渉を回避し、処理期間を短縮し、無傷の植物のマトリックス効果を簡素化できるため、植物中の生体異物の代謝物を正確かつ時間を節約するためのソリューションを提供する可能性があります。代表的な難燃剤・内分泌かく乱物質である2,4-ジブロモフェノールは、土壌中で広く存在し、植物による取り込みの可能性からモデル物質として選定されました。本明細書において、植物カルスは、無菌種子から生成し、滅菌された2,4−ジブロモフェノール含有培養液に曝露した。結果は、2,4-ジブロモフェノールの8つの代謝産物が120時間のインキュベーション後に植物カルス組織で同定されたことを示した。これは、2,4-ジブロモフェノールが植物カルス組織で急速に代謝されたことを示しています。したがって、植物カルス培養プラットフォームは、植物における生体異物の取り込みおよび代謝を評価するための有効な方法である。
Introduction
人為的活動により、ますます多くの有機汚染物質が環境に廃棄されており1,2、土壌はこれらの汚染物質の主要な吸収源と見なされています3,4。土壌中の汚染物質は植物に取り込まれ、作物の消費を通じて直接人体に侵入することにより、食物連鎖に沿って高等栄養レベルの生物に移動する可能性があり、その結果、意図しない曝露につながる可能性があります5,6。植物は解毒のために生体異物を代謝するためにさまざまな経路を利用します7;生体異物の代謝を解明することは、植物の汚染物質の実際の運命を制御するため、重要です。代謝産物は葉(大気中)または根から排泄される可能性があるため、曝露の非常に早い段階で代謝物を決定することで、拡張された数の代謝物を試験する可能性が得られます8。ただし、無傷の植物を使用した研究では、さまざまな要因の影響を受ける可能性のある長期的な実験と複雑なサンプル調製プロトコルが必要です。
したがって、植物カルス培養は、処理時間を大幅に短縮できるため、プランタ中の生体異物の代謝を研究するための優れた代替手段です。これらの培養は、微生物の干渉や光化学的分解を排除し、無傷の植物のマトリックス効果を単純化し、栽培条件を標準化し、実験の労力が少なくて済みます。植物カルス培養は、トリクロサン9、ノニルフェノール10、およびテブコナゾール8の代謝研究における代替アプローチとして首尾よく適用されています。これらの研究は、カルス培養における代謝パターンが無傷の植物の代謝パターンと類似していることを示した。この研究は、複雑で時間のかかるプロトコルなしで、植物中の生体異物の代謝物を効率的かつ正確に同定する方法を提案します。ここでは、植物カルス培養物を高分解能質量分析と組み合わせて使用し、低強度シグナル11,12を持つ代謝物の分析を行います。
この目的のために、ニンジン(Daucus carota var. sativus)カルス懸濁液を100 μg/Lの2,4-ジブロモフェノールに130 rpmおよび26°Cのシェーカーで120時間曝露しました。 2,4-ジブロモフェノールは、その破壊的な内分泌活性13 および土壌中の広範な発生のために選択されました14。代謝産物を抽出し、高分解能質量分析法で分析した。ここで提案されているプロトコルは、イオン化できる他のタイプの有機化合物の プランタ 代謝を調査することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、植物における生体異物の生体内変化を効率的に同定するために開発されました。このプロトコルの重要なステップは、植物カルスの培養です。最も困難な部分は、植物カルスが植物組織に容易に感染して発達するため、植物カルスの分化と維持です。したがって、使用するすべての機器がオートクレーブ処理され、すべての操作が無菌条件下で実行されることを確認する?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、中国国家自然科学基金会(21976160)および浙江省公共福祉技術応用研究プロジェクト(LGF21B070006)の支援を受けて行われました。
Materials
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 gas chromatography | Agilent | ||
| ACQULTY ultra-performance liquid chromatography | Waters | ||
| Amber glass vials | Waters | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| C18 column | ACQUITY UPLC BEH | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS capillary column | Agilent | ||
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| N-hexane | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| Nitrogen blowing instrument | AOSHENG | MD200-2 | |
| NP isomers, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Oasis HLB cartridges | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus | Eppendorf | 100-1000 µL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. | THZ-98AB | |
| Solid phase extractor | AUTO SCIENCE | ||
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized ultra-clean workbench | AIRTECH |
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