식물에서 2,4-dibromophenol의 대사 해명
Summary
본 프로토콜은 식물에서 2,4-디브로모페놀 대사산물을 식별하기 위한 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다.
Abstract
토양은 환경으로 버려지는 오염 물질의 주요 흡수원이기 때문에 작물은 유기 오염 물질에 광범위하게 노출될 수 있습니다. 이것은 오염 물질이 축적된 식품의 섭취를 통해 잠재적인 인체 노출을 만듭니다. 작물에서 생체이물의 흡수와 대사를 밝히는 것은 인간의 식이 노출 위험을 평가하는 데 필수적입니다. 그러나 이러한 실험을 위해 온전한 식물을 사용하려면 다양한 요인의 영향을 받을 수 있는 장기간의 실험과 복잡한 샘플 준비 프로토콜이 필요합니다. 고분해능 질량분석법(HRMS)과 결합된 식물 캘러스 배양은 미생물 또는 곰팡이 미세 환경의 간섭을 피하고 처리 기간을 단축하며 온전한 식물의 매트릭스 효과를 단순화할 수 있기 때문에 식물에서 생체 이물 대사 산물을 정확하고 시간 절약적으로 식별할 수 있는 솔루션을 제공할 수 있습니다. 전형적인 난연제 및 내분비 교란 물질인 2,4-디브로모페놀은 토양에서 널리 발생하고 식물에 의한 흡수 가능성으로 인해 모델 물질로 선택되었습니다. 본원에서, 식물 캘러스는 무균 종자로부터 생성되었고, 멸균된 2,4-디브로모페놀-함유 배양 배지에 노출되었다. 그 결과 배양 120시간 후 식물 캘러스 조직에서 2,4-디브로모페놀의 8개 대사산물이 확인된 것으로 나타났습니다. 이는 2,4-디브로모페놀이 식물 캘러스 조직에서 빠르게 대사되었음을 나타냅니다. 따라서 식물 캘러스 배양 플랫폼은 식물에서 생체이물의 흡수와 대사를 평가하는 효과적인 방법입니다.
Introduction
인위적 활동으로 인해 점점 더 많은 수의 유기 오염 물질이 환경으로 버려지고 있으며1,2, 토양은 이러한 오염 물질의 주요 흡수원으로 간주됩니다 3,4. 토양의 오염 물질은 식물에 의해 흡수될 수 있으며 작물 소비를 통해 인체에 직접 유입되어 결과적으로 의도하지 않은 노출로 이어짐으로써 먹이 사슬을 따라 더 높은 영양 수준의 유기체로 잠재적으로 옮겨질 수 있습니다 5,6. 식물은 해독을 위해 생체이물(xenobiotics)을 대사하기 위해 다양한 경로를 이용한다7; 생체이물의 신진대사를 밝히는 것은 식물에서 오염 물질의 실제 운명을 통제하기 때문에 중요합니다. 대사 산물은 잎에 의해 (대기로) 또는 뿌리로 배설될 수 있기 때문에, 노출 초기 단계에서 대사 산물을 결정하면 더 많은 수의 대사 산물을 검사할 수 있다8. 그러나 온전한 식물을 사용한 연구에는 다양한 요인의 영향을 받을 수 있는 장기간의 실험과 복잡한 샘플 준비 프로토콜이 필요합니다.
따라서 식물 캘러스 배양은 치료 시간을 크게 단축할 수 있기 때문에 플란타에서 생체이물의 대사를 연구하는 데 좋은 대안입니다. 이러한 배양은 미생물 간섭 및 광화학적 분해를 배제하고, 손상되지 않은 식물의 매트릭스 효과를 단순화하고, 재배 조건을 표준화하고, 실험 노력을 덜 필요로 합니다. 식물 캘러스 배양은 트리클로산 9, 노닐페놀10 및 테부코나졸8의 대사 연구에서 대체 접근법으로 성공적으로 적용되었습니다. 이 연구는 캘러스 배양의 대사 패턴이 온전한 식물의 대사 패턴과 유사하다는 것을 보여주었습니다. 본 연구는 복잡하고 시간이 많이 소요되는 프로토콜 없이 식물에서 생체이물 대사산물을 효율적이고 정확하게 식별할 수 있는 방법을 제안한다. 여기에서 우리는 저강도 신호11,12를 가진 대사 산물을 분석하기 위해 고분해능 질량 분석법과 함께 식물 캘러스 배양을 사용합니다.
이를 위해 당근(Daucus carota var. sativus) 캘러스 현탁액을 130rpm 및 26°C의 진탕기에서 120시간 동안 2,4-디브로모페놀 100μg/L에 노출시켰다. 2,4-디브로모페놀은 파괴적인 내분비 활동(endocrine activity)13 과 토양(토양)에서의 광범위한 발생14 때문에 선택되었다. 대사 산물을 추출하고 고해상도 질량 분석법으로 분석했습니다. 여기에서 제안된 프로토콜은 이온화될 수 있는 다른 유형의 유기 화합물의 플란타 대사를 조사할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 식물에서 생체이물의 생체 변형을 효율적으로 식별하기 위해 개발되었습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 식물 캘러스의 배양입니다. 가장 어려운 부분은 식물 캘러스의 분화와 유지인데, 식물 캘러스는 식물 조직에 쉽게 감염되어 발달하기 때문입니다. 따라서 사용되는 모든 장비가 고압 증기 멸균되어 있고 모든 작업이 무균 조건에서 수행되는지 확인하는 것이 중요합니다. ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단(21976160)과 저장성 공공 복지 기술 응용 연구 프로젝트(LGF21B070006)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 gas chromatography | Agilent | ||
| ACQULTY ultra-performance liquid chromatography | Waters | ||
| Amber glass vials | Waters | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| C18 column | ACQUITY UPLC BEH | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS capillary column | Agilent | ||
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| N-hexane | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| Nitrogen blowing instrument | AOSHENG | MD200-2 | |
| NP isomers, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Oasis HLB cartridges | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus | Eppendorf | 100-1000 µL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. | THZ-98AB | |
| Solid phase extractor | AUTO SCIENCE | ||
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized ultra-clean workbench | AIRTECH |
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