Belyse metabolismen av 2,4-dibromofenol i planter
Summary
Denne protokollen beskriver en enkel og effektiv metode for identifisering av 2,4-dibromofenolmetabolitter i planter.
Abstract
Avlinger kan bli utsatt for organiske forurensninger, siden jord er en stor vask for forurensende stoffer som kastes ut i miljøet. Dette skaper potensiell menneskelig eksponering gjennom forbruk av forurensende akkumulerte matvarer. Belysning av opptak og metabolisme av xenobiotika i avlinger er avgjørende for vurderingen av dietteksponeringsrisiko hos mennesker. For slike eksperimenter krever imidlertid bruk av intakte planter langsiktige eksperimenter og komplekse prøveprepareringsprotokoller som kan påvirkes av ulike faktorer. Plantekalluskulturer kombinert med høyoppløselig massespektrometri (HRMS) kan gi en løsning for nøyaktig og tidsbesparende identifisering av metabolitter av xenobiotika i planter, da det kan unngå forstyrrelser fra det mikrobielle eller soppmikromiljøet, forkorte behandlingsvarigheten og forenkle matrikseffekten av intakte planter. 2,4-dibromofenol, et typisk flammehemmende og hormonforstyrrende middel, ble valgt som modellsubstans på grunn av dets utbredte forekomst i jord og dets opptakspotensial av planter. Her ble plantekallus generert fra asepsefrø og utsatt for sterilt 2,4-dibromofenolholdig kulturmedium. Resultatene viste at åtte metabolitter av 2,4-dibromofenol ble identifisert i planten callus vev etter 120 timers inkubasjon. Dette indikerer at 2,4-dibromofenol raskt ble metabolisert i planten callus vev. Dermed er plantekalluskulturplattformen en effektiv metode for å evaluere opptak og metabolisme av xenobiotika i planter.
Introduction
Stadig flere organiske miljøgifter har blitt sluppet ut i miljøet på grunn av menneskeskapte aktiviteter 1,2, og jord regnes som et stort sluk for disse miljøgiftene 3,4. Forurensningene i jorda kan tas opp av planter og potensielt overføres til høyere trofiske organismer langs næringskjedene, ved å komme direkte inn i menneskekroppen gjennom avlingsforbruk, og dermed føre til utilsiktet eksponering 5,6. Planter bruker forskjellige veier for å metabolisere xenobiotika for avgiftning7; Det er viktig å belyse metabolismen av xenobiotika, da den kontrollerer den faktiske skjebnen til forurensninger i planter. Siden metabolittene kan skilles ut av blader (til atmosfæren) eller røttene, gir bestemmelse av metabolittene i de svært tidlige fasene av eksponeringen dermed muligheten til å teste et utvidet antall metabolitter8. Imidlertid krever studier ved bruk av intakte planter langsiktige eksperimenter og komplekse prøveprepareringsprotokoller som kan påvirkes av ulike faktorer.
Plantekalluskulturer er derfor et godt alternativ for å studere metabolismen av xenobiotika i planta, da de i stor grad kan forkorte behandlingstiden. Disse kulturene utelukker mikrobiell interferens og fotokjemisk nedbrytning, forenkler matriseeffekten av intakte planter, standardiserer dyrkingsforholdene og krever mindre eksperimentell innsats. Plant callus kulturer har blitt brukt som en alternativ tilnærming i metabolske studier av triclosan9, nonylfenol10 og tebukonazol8. Disse studiene viste at de metabolske mønstrene i calluskulturer var lik de i intakte planter. Denne studien foreslår en metode for effektiv og nøyaktig identifisering av metabolitter av xenobiotika i planter uten komplekse og tidkrevende protokoller. Her bruker vi plantekalluskulturer i kombinasjon med høyoppløselig massespektrometri for analyse av metabolitter med lavintensitetssignaler11,12.
Til dette formål ble gulrot (Daucus carota var. sativus) kallussuspensjoner utsatt for 100 μg / l 2,4-dibromofenol i 120 timer i en shaker ved 130 o / min og 26 ° C. 2,4-dibromofenol ble valgt på grunn av sin forstyrrende endokrine aktivitet13 og utbredt forekomst i jord14. Metabolittene ble ekstrahert og analysert ved høyoppløselig massespektrometri. Protokollen foreslått her kan undersøke in planta metabolisme av andre typer organiske forbindelser som kan ioniseres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen ble utviklet for effektivt å identifisere biotransformasjonen av xenobiotika i planter. Det kritiske trinnet i denne protokollen er kulturen til planten callus. Den vanskeligste delen er differensiering og vedlikehold av planten callus, fordi planten callus er lett infisert og utviklet til å plante vev. Derfor er det viktig å sørge for at alt utstyr som brukes er autoklavert, og at alle operasjoner utføres under aseptiske forhold. Differensiering og vedlikehold av planten callus bør gjøres i mør…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (21976160) og Zhejiang Province Public Welfare Technology Application Research Project (LGF21B070006).
Materials
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 gas chromatography | Agilent | ||
| ACQULTY ultra-performance liquid chromatography | Waters | ||
| Amber glass vials | Waters | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| C18 column | ACQUITY UPLC BEH | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS capillary column | Agilent | ||
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| N-hexane | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| Nitrogen blowing instrument | AOSHENG | MD200-2 | |
| NP isomers, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Oasis HLB cartridges | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus | Eppendorf | 100-1000 µL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. | THZ-98AB | |
| Solid phase extractor | AUTO SCIENCE | ||
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized ultra-clean workbench | AIRTECH |
Referências
- Chakraborty, P., et al. Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities. Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).
- Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments. Science of the Total Environment. 711, 135048 (2020).
- Xu, Y. W., et al. Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil. Chemosphere. 277, 130232 (2021).
- Cai, Q. Y., et al. Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).
- Wang, S. Y., et al. et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation. Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).
- Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).
- Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. Pesticide metabolism in plants and microorganisms. Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).
- Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).
- Macherius, A., et al. Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment. Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).
- Sun, J. Q., et al. Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation. Environmental Pollution. 270, 116064 (2021).
- Schymanski, E. L., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).
- Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study. Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).
- Ren, Z., et al. Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China. Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).
- de Wit, C. A. An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).
- Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).
- Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures. Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).
- Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go. Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).
- Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens. Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).
- Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).
- Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).
