Elucidación del metabolismo del 2,4-dibromofenol en plantas
Summary
El presente protocolo describe un método simple y eficiente para la identificación de metabolitos de 2,4-dibromofenol en plantas.
Abstract
Los cultivos pueden estar ampliamente expuestos a contaminantes orgánicos, ya que el suelo es un sumidero importante para los contaminantes desechados en el medio ambiente. Esto crea una exposición humana potencial a través del consumo de alimentos acumulados con contaminantes. Esclarecer la absorción y el metabolismo de los xenobióticos en los cultivos es esencial para evaluar el riesgo de exposición alimentaria en los seres humanos. Sin embargo, para tales experimentos, el uso de plantas intactas requiere experimentos a largo plazo y protocolos complejos de preparación de muestras que pueden verse afectados por varios factores. Los cultivos de callos vegetales combinados con espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) pueden proporcionar una solución para la identificación precisa y rápida de metabolitos de xenobióticos en plantas, ya que pueden evitar la interferencia del microambiente microbiano o fúngico, acortar la duración del tratamiento y simplificar el efecto matriz de las plantas intactas. El 2,4-dibromofenol, un retardante de llama y disruptor endocrino típico, se eligió como sustancia modelo debido a su presencia generalizada en el suelo y a su potencial de absorción por las plantas. En este trabajo, el callo vegetal se generó a partir de semillas de asepsia y se expuso a un medio de cultivo estéril que contenía 2,4-dibromofenol. Los resultados mostraron que se identificaron ocho metabolitos de 2,4-dibromofenol en los tejidos de callos de la planta después de 120 h de incubación. Esto indica que el 2,4-dibromofenol se metabolizó rápidamente en los tejidos callosos de las plantas. Por lo tanto, la plataforma de cultivo de callos vegetales es un método eficaz para evaluar la absorción y el metabolismo de los xenobióticos en las plantas.
Introduction
Un número cada vez mayor de contaminantes orgánicos han sido descartados en el medio ambiente debido a las actividades antropogénicas 1,2, y el suelo se considera un importante sumidero de estos contaminantes 3,4. Los contaminantes del suelo pueden ser absorbidos por las plantas y potencialmente transferidos a organismos de nivel trófico superior a lo largo de las cadenas alimentarias, entrando directamente en el cuerpo humano a través del consumo de cultivos, lo que conduce a una exposición no intencionada 5,6. Las plantas utilizan diferentes vías para metabolizar los xenobióticos para la desintoxicación7; Dilucidar el metabolismo de los xenobióticos es importante, ya que controla el destino real de los contaminantes en las plantas. Dado que los metabolitos pueden ser excretados por las hojas (a la atmósfera) o las raíces, la determinación de los metabolitos en las primeras fases de la exposición ofrece la posibilidad de analizar un número prolongado de metabolitos8. Sin embargo, los estudios con plantas intactas requieren experimentos a largo plazo y protocolos complejos de preparación de muestras que pueden verse afectados por diversos factores.
Los cultivos de callos vegetales, por lo tanto, son una buena alternativa para estudiar el metabolismo de los xenobióticos en planta, ya que pueden acortar en gran medida el tiempo de tratamiento. Estos cultivos excluyen la interferencia microbiana y la degradación fotoquímica, simplifican el efecto matriz de las plantas intactas, estandarizan las condiciones de cultivo y requieren menos esfuerzo experimental. Los cultivos de callos vegetales se han aplicado con éxito como un enfoque alternativo en estudios metabólicos de triclosán9, nonilfenol10 y tebuconazol8. Estos estudios mostraron que los patrones metabólicos en los cultivos de callos eran similares a los de las plantas intactas. Este estudio propone un método para la identificación eficiente y precisa de metabolitos de xenobióticos en plantas sin protocolos complejos y que requieren mucho tiempo. Aquí, utilizamos cultivos de callos vegetales en combinación con espectrometría de masas de alta resolución para el análisis de metabolitos con señales de baja intensidad11,12.
Con este fin, las suspensiones de callos de zanahoria (Daucus carota var. sativus) se expusieron a 100 μg/L de 2,4-dibromofenol durante 120 h en un agitador a 130 rpm y 26 °C. Se eligió el 2,4-dibromofenol debido a su actividad endocrina disruptiva13 y su presencia generalizada en el suelo14. Los metabolitos fueron extraídos y analizados por espectrometría de masas de alta resolución. El protocolo aquí propuesto puede investigar el metabolismo in planta de otros tipos de compuestos orgánicos que pueden ser ionizados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo fue desarrollado para identificar eficientemente la biotransformación de xenobióticos en plantas. El paso crítico de este protocolo es el cultivo del callo de la planta. La parte más difícil es la diferenciación y el mantenimiento del callo de la planta, porque el callo de la planta se infecta fácilmente y se convierte en tejidos vegetales. Por lo tanto, es importante asegurarse de que todos los equipos utilizados estén esterilizados en autoclave y que todas las operaciones se realicen en condicion…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (21976160) y el Proyecto de Investigación de Aplicación de Tecnología de Bienestar Público (LGF21B070006) de la provincia de Zhejiang.
Materials
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 gas chromatography | Agilent | ||
| ACQULTY ultra-performance liquid chromatography | Waters | ||
| Amber glass vials | Waters | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| C18 column | ACQUITY UPLC BEH | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS capillary column | Agilent | ||
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| N-hexane | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| Nitrogen blowing instrument | AOSHENG | MD200-2 | |
| NP isomers, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Oasis HLB cartridges | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus | Eppendorf | 100-1000 µL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. | THZ-98AB | |
| Solid phase extractor | AUTO SCIENCE | ||
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized ultra-clean workbench | AIRTECH |
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