Skeletmuskelfunktion kan vurderes ved at kvantificere kontraktiliteten af isolerede muskelfibre, traditionelt ved hjælp af besværlige tilgange med lav kapacitet. Her beskriver vi en optikbaseret metode med høj kapacitet til at kvantificere kontraktiliteten af hydrogelindlejrede muskelfibre. Denne tilgang har applikationer til lægemiddelscreening og terapeutisk udvikling.
In vitro cellekultur er et kraftfuldt værktøj til at vurdere cellulære processer og teste terapeutiske strategier. For skeletmuskulatur involverer de mest almindelige tilgange enten differentiering af myogene stamceller i umodne myorør eller kortvarig ex vivo-kultur af isolerede individuelle muskelfibre. En vigtig fordel ved ex vivo-kultur frem for in vitro er bevarelsen af den komplekse cellulære arkitektur og kontraktile egenskaber. Her beskriver vi en eksperimentel protokol til isolering af intakte flexor digitorum brevis muskelfibre fra mus og deres efterfølgende ex vivo-kultur . I denne protokol er muskelfibre indlejret i en fibrinbaseret og kældermembranmatrixhydrogel for at immobilisere fibrene og opretholde deres kontraktile funktion. Vi beskriver derefter metoder til at vurdere muskelfiberkontraktilfunktionen ved hjælp af et optikbaseret kontraktilitetssystem med høj kapacitet. De indlejrede muskelfibre stimuleres elektrisk for at fremkalde sammentrækninger, hvorefter deres funktionelle egenskaber, såsom sarkomerforkortelse og kontraktil hastighed, vurderes ved hjælp af optikbaseret kvantificering. Kobling af muskelfiberkultur med dette system muliggør high-throughput test af virkningerne af farmakologiske midler på kontraktil funktion og ex vivo undersøgelser af genetiske muskellidelser. Endelig kan denne protokol også tilpasses til at studere dynamiske cellulære processer i muskelfibre ved hjælp af levende cellemikroskopi.
Fremskridt inden for de vitro-cellekulturteknikker har åbnet nye muligheder for at studere vævsregenerative evner, patofysiologiske cellulære mekanismer og efterfølgende terapeutiske strategier, alt sammen under anvendelse af pattedyrvæv under velkontrollerede forhold 1,2,3. Anvendelsen af de vitro-dyrkningssystemer er veletableret inden for muskelforskningsområdet 4,5. Generelt anvendes in vitro-differentierede umodne myorør fra myogene stamceller 2,6,7,8. Selvom der er gjort fremskridt i differentieringsprotokollen for at generere mere modne muskelfibre9, begrænser deres umodenhed stadig oversættelsen af resultaterne til en in vivo-indstilling 1,10. Et centralt spørgsmål inden for muskelbiologiområdet er manglende evne til in vitro-differentierede myorør til fuldt ud at indbegrebet af de komplekse intracellulære strukturer, cellesignaleringsprocesser og ekstracellulære interaktioner, der observeres i naturligt muskelvæv og, vigtigere, rekapitulere de kontraktile kræfter produceret af muskelfibre 1,2,10,11,12 . Derudover resulterer den ukoordinerede sammentrækning af myorør under differentieringsprocessen ofte i spontan løsrivelse fra kulturskålene, hvilket gør den kontraktile vurdering af in vitro-differentierede myorør udfordrende og begrænset til kvalitativ eller semikvantitativ evaluering 8,11,12,13. Disse begrænsninger kræver ofte regelmæssige in vivo-forsøg med dyr, især hvis muskelkontraktilitet er et primært eksperimentelt resultat1.
Et alternativ til dyrkning in vitro-differentierede myorør er ex vivo-kulturen af isolerede modne muskelfibre 1,14. Under ex vivo-dyrkning udskilles udviklingsmæssigt modent muskelvæv fra kroppen, efterfulgt af enkeltcelleisolering til dyrkning under laboratoriebetingelser 1,14. De isolerede modne muskelfibre opretholder deres komplekse cellulære strukturer observeret i det oprindelige væv14,15, og denne metode åbner mulighed for direkte interventioner, såsom genetisk manipulation og lægemiddelscreening, i et veldefineret og kontrollerbart kulturmiljø. En af de første rapporter om skeletmuskelfiberisolering og ex vivo-kultur går tilbage til 1930’erne; Udbyttet af levedygtige fibre fra denne protokol var imidlertid lavt16. Med den kontinuerlige optimering af isolationsproceduren og dyrkningsbetingelserne er en betydelig forbedring af mængden af levedygtige og funktionelle muskelfibre nu mulig 14,15,17,18,19. En sådan forbedring af dyrkningsbetingelserne involverer belægning af kulturskåle med ekstracellulære matrixproteiner for at fremme vedhæftningen af de isolerede muskelfibre på kulturskålen15,18,20. Normalt anvendes lamininbelægning, da laminin er et af de mest rigelige elementer inden for den ekstracellulære matrix af muskler20,21. Optimeringen af isolationsproceduren kombineret med belægningen af dyrkningsskålene har gjort det muligt for muskelforskningsfeltet at holde isolerede levedygtige muskelfibre med intakt cellulær arkitektur og kontraktil funktionalitet i kultur i korte perioder 1,15,18,22.
Den mest konventionelle tilgang, der anvendes inden for muskelfeltet til at måle kraft og kontraktile evner, er at montere individuelle muskelfibre mellem en længdedrivermotor og en krafttransducer23,24. Generelt dissekeres muskelfibrene, der anvendes til disse motordrevne opsætninger, fra enten snapfrosset eller frisk væv efterfulgt af permeabilisering eller “skinning”, hvilket muliggør ekstern calciumaktivering, hvor varierende calciumkoncentrationer anvendes til at inducere muskelfiberkontraktion24. Mens denne metode er guldstandarden for muskelfiberkontraktile målinger, kan kun en enkelt muskelfiber måles ad gangen, hvilket gør denne teknik til en besværlig og tidskrævende procedure25. Desuden forstyrrer isolerings- og flåningsproceduren for muskelfibrene de forskellige strukturer, der er involveret i excitationskontraktionskobling (dvs. calciumfrigivelse og efterfølgende genoptagelse i det sarkoplasmatiske retikulum), hvorved det ikke er muligt at studere afslapningskinetik og sygdomme, der kan påvirke denne proces26,27. Et alternativ til det flåede fiberpræparat er at bruge mekanisk dissektion til at isolere intakte muskelfibre, hvor kontraktile kræfter kan måles som reaktion på elektrisk aktivering28; Denne tilgang er imidlertid teknisk udfordrende og meget tidskrævende, hvilket resulterer i målinger med lavt gennemløb. Endelig fjernes muskelcellerne fuldstændigt fra det ekstracellulære miljø under kontraktile målinger 24 i både flåede og intakte præparater, hvilket gør det umuligt at undersøge effekten af den ekstracellulære matrixsammensætning/stivhed på muskelfiberkontraktion24. Som et resultat er udviklingen af alternative metoder nødvendig for at muliggøre muskelfiberkontraktilitetsmålinger af isolerede intakte muskelfibre på en høj gennemstrømningsmåde, samtidig med at forbindelsen mellem muskelfibre og den ekstracellulære matrix genskabes.
For nylig blev der udviklet en ny optikbaseret tilgang til højkapacitetsmålinger af muskelfiberkontraktilitet29. Dette optikbaserede system måler hyppigheden af sarkomerer for at vurdere sarkomerlængden under sammentrækning ved hjælp af højhastighedsbilleddannelse. Inden for dette system forbliver cellerne på plads i kulturskålen, mens optikken flyttes, hvorved den nødvendige tid mellem målingerne af flere cellerminimeres 29. En stor fordel ved at bruge denne high-throughput, optik-baserede tilgang er, at det giver mulighed for at udvikle kulturforhold, der ligner dem i det oprindelige væv. En tilgang, der anvendes til at efterligne indfødte in vivo-forhold, er indlejring af celler i hydrogeler30. Typisk er en hydrogel et viskoelastisk materiale, der er i stand til at opretholde dets volumen og form, og hydrogeler har egenskaberne af både faste og flydende materialer31. Den faste del består af polymerkæder tværbundet til hinanden, hvilket skaber en struktur, der ligner en netto30,31. Hydrogelernes materialeegenskaber kan indstilles til at efterligne matrixaflejringen af muskler30,31. Således åbner kombinationen af et high-throughput, optikbaseret system med celler indlejret i hydrogeler nye muligheder for at vurdere virkningerne af ekstracellulær matrixsammensætning og mekaniske egenskaber på muskelfiberfunktionalitet.
Det overordnede mål med dette papir er at 1) beskrive metoden til enzymatisk isolering og ex vivo-kultur af muskelfibre under forhold, der efterligner det oprindelige vævsmiljø og 2) vurdere muskelfiberkontraktilitet ved hjælp af en high-throughput tilgang. Vi beskriver en detaljeret metode til let at isolere et stort antal enkelte muskelfibre fra flexor digitorum brevis (FDB) muskel ved hjælp af enzymatisk fordøjelse. Derudover beskriver vi en teknik til at indlejre de isolerede muskelfibre i en fibrinbaseret hydrogel for at efterligne musklernes oprindelige miljø og forbedre muskelfiberens levedygtighed og kontraktilitet. Vi skitserer derefter en metode med høj kapacitet til måling af levende muskelfiberkontraktioner in vitro ved hjælp af dette nyligt udviklede system. En ekstra fordel ved denne indlejringsprocedure er immobilisering af fibre under sammentrækning, hvilket kan forbedre signal-støjforholdet mellem disse målinger. Denne gelindlejringsmetode er anvendelig til både enkeltpolymer- og kompositgelindkapslingsprocedurer, hvilket letter vurderingen af virkningerne af ekstracellulær matrixsammensætning på muskelfiberkontraktilitet.
Her beskriver vi en protokol til udførelse af enzymatisk isolering og kultur af FDB-muskelfibre i et 3D-kulturformat efterfulgt af kontraktile målinger ved hjælp af et optikbaseret kontraktilt målesystem. Denne protokol har en række fordele, herunder 1) ligetil og rettidig isolering af mange intakte muskelfibre fra en enkelt muskel; 2) indlejring af muskelfibrene i en justerbar hydrogelmatrix; 3) udførelsen af kontraktilitetsmålinger med høj kapacitet ved hjælp af det optikbaserede system og 4) evnen til at foretage gentagne målinger af de samme muskelfibre efter en intervention. Isoleringen af enkelte levende muskelfibre giver modne muskelceller, der bevarer deres kontraktile funktion. Da muskelfibrene opnået fra musens FDB er relativt små, manipuleres de let under isolering og opretholder deres lige form, hvilket muliggør nedstrøms kontraktile målinger. Selvom systemet primært blev udviklet til at studere kardiomyocytkontraktion, indeholder skeletmuskelfibre det samme kontraktile maskineri med let skelneligt sarkomermønster og kan således også måles ved hjælp af dette system29. Koblingen af enkeltcellekontraktile målinger med levende ex vivo muskelfiberkultur er et kraftfuldt værktøj til at vurdere modne muskelfibres sundhed og funktion som reaktion på elektrisk aktivering.
En begrænsning ved anvendelse af dissocierede muskelfibre er manglen på eksterne kræfter (dvs. passiv strækning) påført fibrene, hvilket resulterer i lavere hvilende sarkomomerlængder sammenlignet med dem, der findes in vivo. Selvom en sarkomerlængde på 2,4-2,5 μm sikrer optimal kraftproduktion, kan hvilesarkomerlængden variere meget33. Mens in vivo hvilesarkomerlængden af FDB endnu ikke er blevet beskrevet, tyder vores egne upublicerede data på en gennemsnitlig længde på 2,2 μm. De aktuelle resultater viser en gennemsnitlig hvilesarkomerlængde på ~ 1,95 μm i ubelastede FDB-fibre efter 24 timer i kultur (figur 3). Selvom denne lavere hvilende sarkomerlængde ville resultere i lavere kraftproduktion, bør en længde på ~ 1,95 μm stadig producere >90% af den maksimale kraft34. Som sådan bør disse sarkomerlængder være tilstrækkelige til at bestemme forskelle i fiberfunktion mellem forskellige genetiske modeller eller efter lægemiddelbehandlinger. Derudover giver indlejringen af fibre i en hydrogel mange yderligere punkter for vedhæftning sammenlignet med fritflydende 2D-dyrkede fibre, hvilket ville begrænse yderligere sarkomerforkortelse over tid.
En fordel ved denne muskelfiberisoleringsprotokol er brugen af en let dissekeret hurtig muskel bestående af relativt små muskelfibre sammenlignet med andre muskler, såsom extensor digitorum longus (EDL). Deres mindre størrelse gør muskelisoleringen mere velegnet til triturationsbaseret adskillelse, hvilket reducerer risikoen for pipet- eller sammenfiltringsinduceret skade på muskelfibrene. Den ekstracellulære matrix af FDB-muskler kan let enzymatisk fordøjes med kollagenase, hvilket muliggør isolering af hundredvis af muskelfibre på kort tid. Overfordøjelse kan dog føre til skade på muskelfibrene. Overfordøjelsen af muskelfibrene kan genkendes, når musklen falder fra hinanden næsten øjeblikkeligt, når musklen tritureres, eller når en stor del af cellevolumenet hyperkontraheres under cellesåningsproceduren. For at forhindre overfordøjelse af musklen skal fordøjelsestiden optimeres for hver kollagenasebatch. For at teste dette skal to FDB-muskler fordøjes parallelt med en forskudt fordøjelsestid på 5 min mellem dem. Fordøjelsestiden med det højeste udbytte af levedygtige muskelfibre bør vælges. Denne optimering skal derefter udføres en anden gang, igen med 5 minutters adskillelse i fordøjelsestiden. Fordøjelsestiden, der giver de højest levedygtige muskelfibre, bør anvendes som den optimale fordøjelsestid for den aktuelle batch af collagenase. En anden måde at begrænse batch-til-batch-variabiliteten af collagenase ville være direkte at beregne aktivitetsenhederne pr. milliliter stamopløsning og derefter rekonstituere de efterfølgende kollagenasebatcher til samme mængde. Endelig kan det være nødvendigt at optimere fordøjelsestiderne på tværs af forskellige musestammer, for eksempel hvis man studerer ældre eller syge dyr, der udviser øget ekstracellulær matrixaflejring35,36.
Muligheden for pipettering af levedygtige isolerede muskelfibre åbner muligheder for dyrkning af FDB-muskelfibre under forskellige dyrkningsforhold. En sådan mulighed er dyrkning af disse fibre i hydrogeler for at efterligne det oprindelige vævskulturmiljø. Denne indlejringsprotokol sikrer, at fibrene forbliver på plads under kontraktile målinger og er optimeret til at lade fibrene sætte sig i bunden af pladen, før gelen sætter sig. Det kan dog være nødvendigt at justere denne protokol for at tage hensyn til forskelle i trombin- og fibrinogenbestandene. Hvis trombinaktiviteten er for høj, vil gelen sætte sig for tidligt, og fibrene kan forblive suspenderet på højere steder uden for mikroskopets brændplan. Hvis dette sker, skal trombin:fibrinogenforholdet justeres. Dette kan testes ved plettering af fibre i stadig lavere trombinkoncentrationer og notere, hvor lang tid polymerisationen tager. Dette bør typisk ikke ske hurtigere end 30 min. At have en trombinkoncentration, der er for lav, kan imidlertid også forringe polymerisationsprocessen. En anden metode til at sikre, at fibrene er i det korrekte brændplan, er først at frø dem ved hjælp af en 2D-protokol og derefter tilføje et lag hydrogel over fibrene, efter at de har klæbet til kulturpladen. Man skal dog være opmærksom på, at fjernelse af mediet fra fibrene kan fremkalde hypersammentrækning, da de er følsomme over for udtørring. Det er også uklart, om hydrogelen vil fastgøre fuldt ud til kulturpladen, og det kan løsne sig lettere. Derfor foretrækkes denne indlejringsprocedure for at holde fibre levedygtige og på plads til sammentrækningsmålinger.
Brugen af denne protokol muliggør undersøgelse af kontraktil dynamik af modne muskelfibre ex vivo og kan anvendes på både raske mus og dem, der bærer genetiske mutationer for muskelsygdomme. Ligeledes muliggør det test af, hvordan kulturbetingelser eller tilsætning af forbindelser påvirker muskelfiberfunktionen. De kontraktile data opnået ved hjælp af det optikbaserede system giver en indikation af kontraktiliteten af levende enkeltmuskelfibre, og ændringer i denne evne kan korreleres med fibersundhed. Disse data alene er imidlertid ikke tilstrækkelige til at afgøre, om disse ændringer forekommer i actin-myosin krydsbrobygning eller calciumfrigivelsesstadier af muskelkontraktion. Selvom vi ikke beskriver metoder til måling af calciumsignalering i denne protokol, er denne opsætning også i stand til at måle Fura-baserede calciumtransienter i kontraherende muskelceller29. En ulempe ved dette system er, at FDB-musklen kun indeholder hurtige træk type IIa / IIx muskelfibre, og muskler, der indeholder langsomme træk type I-fibre af denne størrelse, er endnu ikke beskrevet37. Dette eliminerer evnen til at studere fibertypespecifik funktion ved hjælp af denne metode. Den protokol, vi foreslår her, kan potentielt tilpasses andre muskler såsom EDL eller soleus for at studere fibertypeforskelle. På grund af deres større størrelse skal denne protokol optimeres yderligere til disse muskler. Længere fibre har tendens til at blive sammenfiltret under tyngdekraftssedimenteringstrinnet og vil briste, hvis de manipuleres ved pipettering, hvilket ville føre til lavere udbytte. På grund af deres uforenelighed med pipettering er længere fibre derfor også mindre kompatible med gelindlejringsteknikken. Målinger af disse fibre kan stadig udføres i et 2D-kulturformat, men fibrene kan bevæge sig mere rundt under sammentrækning på grund af deres størrelse og dermed påvirke signal-støj-forholdet. En anden begrænsning af dette system er manglende evne til at udføre kraftmålinger sammen med kontraktile målinger, såsom de kraftmålinger, der kan opnås ved hjælp af andre intakte muskelfiberpræparater28. Denne begrænsning kan dog omgås ved at estimere den kraft, der genereres af muskelfiberen. Den genererede kraft af muskelfibre kan estimeres, hvis muskelfiberformen under kontraherede og afslappede tilstande såvel som Youngs matrixmodul er kendt25. Ikke desto mindre giver dette optiske baserede system en brugervenlig tilgang med høj kapacitet til at studere muskelkontraktil funktion og åbner en række nye muligheder for at studere genetiske muskelsygdomme og terapeutiske indgreb.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Sylvia Bogaards, Sanna Luijcx, Valentijn Jansen, Michiel Helmes og Emmy Manders for deres tekniske ekspertise i at hjælpe med at udvikle denne protokol. Dette arbejde blev støttet af priser fra Muskelsvindforeningen (Development Award MDA603238 til T.J.K), Dutch Cardiovascular Alliance (Talent Grant to T.J.K) og National Health and Medical Research Council (NHMRC, Australien; Fellowship APP1121651 til M.Y).
Aprotinin, from Bovine Lung | Thermo Scientific | AAJ63039MC | 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
Collagenase type 2 | Worthington | 77336 | 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous. |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma Aldrich | 50-176-5054 | 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413201 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
Gibco MEM High glucose + pyruvate | Thermo Fisher | 11095080 | |
Horse serum | Thermo Fisher | H1270 | |
Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Serum Replacement 2 (50x) | Sigma Aldrich | S9388 | |
Thrombin, Bovine Plasma | Thermo Scientific | AAJ63383EXP | 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
Tranexamic Acid | Thermo Scientific | AC228042500 | 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
Equipment | |||
24-well electrical stimulator | IonOptix | N/a | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
MultiCell Cytocypher | IonOptix | N/a | |
MyoCam-S3 | IonOptix | N/a | |
MyoPacer | IonOptix | N/a | |
SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent | Dow corning | N/a | |
Vannas Spring Scissor – 25 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15002-08 | |
Software | |||
CytoSolver | IonOptix | N/a | |
IonWizard | IonOptix | N/a |