Xenogene (chemische oder tierische) Produkte, die in den Vorbereitungs-/Manipulationsschritten der Zelltherapie eingeführt werden, sind mit einem erhöhten Risiko für Immunreaktivität und pathogene Übertragung bei Wirtspatienten verbunden. Hier wird eine vollständige xenogenfreie Methode zur Isolierung und in vitro Expansion von humanen adipösen Stammzellen beschrieben.
In Anbetracht der zunehmenden Auswirkungen der Stammzelltherapie wurden Bedenken hinsichtlich der biologischen Sicherheit hinsichtlich einer möglichen Kontamination oder Infektionsübertragung aufgrund der Einführung tierischer Produkte während der In-vitro-Manipulation geäußert. Die xenogenen Komponenten, wie Kollagenase oder fötales Rinderserum, die üblicherweise während der Zellisolierungs- und Expansionsschritte verwendet werden, könnten mit den potenziellen Risiken einer Immunreaktivität oder einer Virus-, Bakterien- und Prioneninfektion bei den empfangenden Patienten in Verbindung gebracht werden. Gemäß den Richtlinien der guten Herstellungspraxis sollte eine chemische Gewebedissoziation vermieden werden, während fetales Rinderserum (FBS) durch xenogenfreie Nahrungsergänzungsmittel ersetzt werden kann. Um die Sicherheit von Zellprodukten zu gewährleisten, ist es außerdem wichtig, zuverlässigere und reproduzierbarere Methoden zu definieren. Wir haben eine innovative, vollständig xenogenfreie Methode zur Isolierung und In-vitro-Expansion von humanen Fettstammzellen entwickelt, ohne deren Eigenschaften im Vergleich zu Kollagenase-FBS-kultivierten Standardprotokollen zu verändern. Hier wurden aus menschlichem Fettgewebe gewonnene Stammzellen (hASCs) aus abdominalem Fettgewebe isoliert. Die Probe wurde mechanisch mit einer Schere/einem Skalpell zerkleinert, mikropräpariert und mechanisch in einer 10 cm Petrischale dispergiert und mit Skalpellschnitten vorbereitet, um das Anheften der Gewebefragmente und die Migration von hASCs zu erleichtern. Im Anschluss an die Waschschritte wurden hASCs aufgrund ihrer plastischen Adhärenz ohne enzymatischen Aufschluss ausgewählt. Die isolierten hASCs wurden mit Medium kultiviert, das mit 5% heparinfreiem humanem Thrombozytenlysat angereichert und mit einem tierfreien Trypsinersatz abgetrennt wurde. Gemäß den Richtlinien der Guten Herstellungspraxis (GMP) zur Herstellung von Zellprodukten, die für die Humantherapie bestimmt sind, wurden keine Antibiotika in Nährmedien verwendet.
In den letzten Jahrzehnten hat die steigende Nachfrage nach innovativen therapeutischen Behandlungen zu erheblichen Anstrengungen und Ressourceninvestitionen im Bereich der translationalen Medizingeführt 1. Zellbasierte Produkte sind mit Risiken verbunden, die durch die Zellquelle, den Herstellungsprozess (Isolierung, Expansion oder genetische Veränderung) und die nicht-zellulären Nahrungsergänzungsmittel (Enzyme, Wachstumsfaktoren, Kulturzusätze und Antibiotika) bestimmt werden, und diese Risikofaktoren hängen von der spezifischen therapeutischen Indikation ab. Die Qualität, Sicherheit und Wirksamkeit des Endprodukts könnte stark von den oben genannten Elementenbeeinflusst werden 2. Die Stammzelltherapie erfordert die Einhaltung der Grundsätze der biologischen Sicherheit. Die potenziellen Risiken einer pathogenen Übertragung mit tierischen Produkten in Zellkulturen könnten problematisch sein, und die gründliche Prüfung jedes Produkts, das bei der Herstellung eingeführt wird, ist unerlässlich3.
Die traditionelle Methode zur Isolierung von aus menschlichem Fett gewonnenen Stammzellen (hASCs) beinhaltet einen enzymatischen Aufschluss mit Kollagenase, gefolgt von Waschschritten durch Zentrifugation4. Während die enzymatische Isolierung im Allgemeinen in Bezug auf Zellausbeute und Lebensfähigkeit als effizienter angesehen wird als andere mechanische Techniken, werden die verwendeten tierischen Komponenten wie Kollagenase von der US-amerikanischen Food and Drug Administration als mehr als minimal manipuliert angesehen. Dies bedeutet, dass ein signifikant erhöhtes Risiko für Immunreaktionen oder Krankheitsübertragungen besteht, wodurch die Übertragung der hASC-Therapie auf das klinische Umfeld eingeschränktwird 5,6.
Die Trypsin-basierte Verdauung ist ein weiteres enzymatisches Protokoll zur Isolierung von ASCs. Es wurden verschiedene Techniken mit geringfügigen Modifikationen in Bezug auf die Trypsinkonzentration, die Zentrifugationsgeschwindigkeit und die Inkubationszeit beschrieben. Leider ist diese Methode nicht gut beschrieben, und in der Literatur besteht ein Mangel an Vergleichen, insbesondere mit den mechanischen Isolationsprotokollen7. In Bezug auf die Übersetzbarkeit des Ansatzes hat Trypsin jedoch die gleichen Nachteile wie Kollagenase.
Alternative Isolationsmethoden zur Gewinnung von ASCs, die auf mechanischen Kräften und ohne Enzymzugabe basieren, beinhalten eine Hochgeschwindigkeitszentrifugation (800 x g oder 1.280 x g, 15 min) der Fettgewebefragmente. Dann wird das Pellet mit einem Lysepuffer für rote Blutkörperchen (5 min) inkubiert, gefolgt von einem weiteren Zentrifugationsschritt bei 600 x g vor der Resuspension in Kulturmedium. Obwohl in den ersten Tagen im Vergleich zu den Explantatmethoden eine größere Anzahl von Zellen isoliert wurde, zeigte eine frühere Studie eine geringere oder fehlende Proliferation über die zweite Kulturwoche hinaus8.
Darüber hinaus ist eine weitere Manipulation mit xenogenem zugesetztem Medium, wie z. B. fetalem Rinderserum (FBS), das als Wachstumsfaktorergänzung für die Zellkultur verwendet wird, mit einem erhöhten Risiko für Immunreaktivität und Exposition gegenüber viralen, bakteriellen oder Prioneninfektionen des Wirtspatienten verbunden 9,10. Immunreaktionen und die Entwicklung urtikariformer Hautausschläge wurden bereits bei Personen beschrieben, die mehrere Dosen mesenchymaler Stammzellen erhielten, die mit FBS11 hergestellt wurden. Darüber hinaus unterliegt FBS einer Variabilität von Charge zu Charge, die sich auf die Qualität des Endprodukts auswirken kann12.
In Übereinstimmung mit den Richtlinien der Guten Herstellungspraxis (GMP) sollte eine enzymatische Gewebedissoziation vermieden und FBS durch xenogenfreie Nahrungsergänzungsmittel ersetzt werden. Diese Schritte sind zusammen mit zuverlässigeren und reproduzierbareren Protokollen unerlässlich, um die Anwendung der Zelltherapie zu unterstützen 3,13.
In diesem Zusammenhang wurde humanes Thrombozytenlysat (hPL) als Ersatz für FBS vorgeschlagen, da es sich um ein zellfreies, proteinhaltiges, mit Wachstumsfaktoren angereichertes Nahrungsergänzungsmittel handelt, und es wurde früher unter den zellbasierten Produkten in klinischer Qualität als Zusatz von Wachstumsmedium für die In-vitro-Zellkultur und –expansion eingeführt14,15. Da es sich bei hPL um ein vom Menschen stammendes Produkt handelt, wird es häufig als Ersatz für FBS während der In-vitro-Kultur von hASCs verwendet, die für klinische Anwendungen bestimmt sind, wodurch Probleme in Bezug auf immunologische Reaktionen und Infektionen im Zusammenhang mit der FBS-Übersetzbarkeit reduziertwerden 15,16.
Trotz der höheren Produktionskosten konnte bereits gezeigt werden, dass hPL im Vergleich zu FBS die Zelllebensfähigkeit für viele Zelltypen unterstützt, die Proliferation erhöht, die Seneszenz verzögert, die genomische Stabilität gewährleistet und den zellulären Immunphänotyp auch in späten Zellpassagen konserviert. All diese Elemente unterstützen den Wechsel zu dieser Kulturergänzung11.
Ziel dieser Arbeit war es, ein standardisiertes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von hASCs mit einer vollständig tierversuchsfreien Methode zu entwickeln, ohne die Zellphysiologie und die Stammeigenschaften im Vergleich zu klassischen FBS-kultivierten hASCs zu verändern (Abbildung 1).
Aus Fett gewonnene Stammzellen haben in den letzten zehn Jahren aufgrund ihrer Häufigkeit, ihrer schnellen und erschwinglichen Isolationsmethoden, ihrer hohen In-vitro/In-vivo-Proliferationsrate und ihrer Stamm-/Differenzierungseigenschaften das Interesse der translationalen Forschung geweckt18,19,20. Daher gelten hASCs als hervorragender Kandidat für zellbasierte Strategien in der regenerativen Medizin<sup c…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren haben keine Danksagungen.
15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | – | |
Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
Cryovials | clearline | 390701 | |
Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | GIBCO | 11965092 | |
Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | – | |
Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |