Isolering og dyrkning av humane fettavledede stamceller med en innovativ xenogenfri metode for humanterapi

Summary

Xenogene (kjemiske eller dyreavledede) produkter introdusert i celleterapiforberedelses-/manipulasjonstrinnene er forbundet med økt risiko for immunreaktivitet og patogen overføring hos vertspasienter. Her beskrives en komplett xenogenfri metode for isolering og in vitro-ekspansjon av humane fettderiverte stamceller.

Abstract

Tatt i betraktning den økende effekten av stamcellebehandling, har biosikkerhetsproblemer blitt reist angående potensiell forurensning eller infeksjonsoverføring på grunn av innføring av animalske avledede produkter under in vitro-manipulasjon . De xenogene komponentene, som kollagenase eller føtalt bovint serum, som vanligvis brukes under celleisolasjons- og ekspansjonstrinnene, kan være forbundet med de potensielle risikoene for immunreaktivitet eller virus-, bakterie- og prioninfeksjon hos de mottakende pasientene. Etter retningslinjer for god produksjonspraksis bør kjemisk vevsdissosiasjon unngås, mens fosterets bovint serum (FBS) kan erstattes med xenogenfrie kosttilskudd. Videre, for å sikre sikkerheten til celleprodukter, er definisjonen av mer pålitelige og reproduserbare metoder viktig. Vi har utviklet en innovativ, helt xenogenfri metode for isolering og in vitro-utvidelse av humane fettavledede stamceller uten å endre egenskapene sammenlignet med kollagenase FBS-dyrkede standardprotokoller. Her ble humane fettavledede stamceller (hASC) isolert fra abdominalt fettvev. Prøven ble mekanisk hakket med saks/skalpell, mikrodissekert og mekanisk dispergert i en 10 cm petriskål, og fremstilt med skalpellsnitt for å lette festingen av vevsfragmentene og migrasjonen av hASCs. Etter vasketrinnene ble hASC valgt på grunn av deres plastiske adherens uten enzymatisk fordøyelse. De isolerte hASCene ble dyrket med medium supplert med 5 % heparinfritt humant blodplatelysat og løsnet med en dyrefri trypsinsubstitutt. Etter god produksjonspraksis (GMP) anvisninger på produksjon av celleprodukter beregnet for human terapi, ble ingen antibiotika brukt i noen kulturmedier.

Introduction

I de siste tiårene har den økende etterspørselen etter innovative terapeutiske behandlinger gitt opphav til betydelig innsats og ressursinvestering i translasjonsmedisinfeltet¹. Cellebaserte produkter er forbundet med risiko bestemt av cellekilden, produksjonsprosessen (isolasjon, utvidelse eller genetisk modifisering) og de ikke-cellulære kosttilskuddene (enzymer, vekstfaktorer, kulturtilskudd og antibiotika), og disse risikofaktorene avhenger av den spesifikke terapeutiske indikasjonen. Kvaliteten, sikkerheten og effekten av sluttproduktet kan bli dypt påvirket av de ovenfor angitte elementene². Stamcelleterapi krever overholdelse av biosikkerhetsprinsipper; Den potensielle risikoen for patogen overføring med animalske avledede produkter i cellekultur kan være problematisk, og grundig testing av ethvert produkt introdusert i produksjonen er viktig³.

Den tradisjonelle metoden for å isolere humane fettavledede stamceller (hASCs) innebærer en enzymatisk fordøyelse utført med kollagenase etterfulgt av vasketrinn gjennom sentrifugering⁴. Mens enzymatisk isolasjon generelt anses som mer effektiv enn andre mekaniske teknikker når det gjelder celleutbytte og levedyktighet, anses de animalske avledede komponentene som brukes, som kollagenase, mer enn minimalt manipulert av US Food and Drug Administration. Dette betyr at det er en betydelig økt risiko for immunreaksjoner eller sykdomsoverføring, og dermed begrense oversettelsen av hASC-terapi til kliniske innstillinger ^5,6.

Trypsinbasert fordøyelse er en annen enzymatisk protokoll for å isolere ASC-er. Ulike teknikker har blitt beskrevet med små modifikasjoner når det gjelder trypsinkonsentrasjon, sentrifugeringshastighet og inkubasjonstid. Dessverre er denne metoden ikke godt beskrevet, og det finnes en mangel på sammenligning i litteraturen, spesielt med de mekaniske isolasjonsprotokollene⁷. Men når det gjelder oversettbarheten av tilnærmingen, har trypsin de samme ulempene med kollagenase.

Alternative isolasjonsmetoder for å oppnå ASC-er, basert på mekaniske krefter og uten enzymaddisjon, involverer høyhastighets sentrifugering (800 x g eller 1,280 x g, 15 min) av fettvevsfragmentene. Deretter inkuberes pelleten med en lysisbuffer for røde blodlegemer (5 min), etterfulgt av et nytt sentrifugeringstrinn ved 600 x g før resuspensjon i dyrkningsmedium. Til tross for at et større antall celler ble isolert de første dagene sammenlignet med eksplanteringsmetodene, viste en tidligere studie lavere eller fraværende spredning utover den andre uken av kultur⁸.

Dessuten er ytterligere manipulering med xenogent tilsatt medium, som føtalt bovint serum (FBS), som brukes som et vekstfaktortilskudd for cellekultur, forbundet med økt risiko for immunreaktivitet og eksponering for virus-, bakterie- eller prioninfeksjoner hos vertspasienten ^9,10. Immunreaksjoner og utvikling av urtikariform utslett er allerede beskrevet hos personer som får flere doser mesenkymale stamceller produsert med FBS¹¹. Videre er FBS utsatt for batch-til-batch-variabilitet, noe som kan ha innvirkning på sluttproduktkvaliteten¹².

I samsvar med retningslinjer for god produksjonspraksis (GMP) bør enzymatisk vevsdissosiasjon unngås, og FBS bør erstattes med xenogenfrie tilskudd. Disse trinnene, sammen med mer pålitelige og reproduserbare protokoller, er avgjørende for å støtte anvendelsen av celleterapi ^3,13.

I denne sammenheng har humant blodplatelysat (hPL) blitt foreslått som en erstatning for FBS siden det er et cellefritt, proteinholdig, vekstfaktorberiket supplement, og det ble tidligere introdusert blant klinisk cellebaserte produkter som et tilsetningsstoff av vekstmedium for in vitro cellekultur og ekspansjon^14,15. Siden hPL er et humant avledet produkt, brukes det ofte som en erstatning for FBS under in vitro-kulturen av hASC-er beregnet for kliniske applikasjoner, og reduserer dermed problemer med immunologiske reaksjoner og infeksjoner relatert til FBS-oversettbarhet^15,16.

Til tross for de høyere produksjonskostnadene har det allerede blitt påvist at sammenlignet med FBS støtter hPL cellelevedyktighet for mange celletyper, øker spredning, forsinker aldring, sikrer genomisk stabilitet og bevarer den cellulære immunfenotypen selv i sene cellepassasjer; Alle disse elementene støtter overgangen til dette kulturtillegget¹¹.

Målet med dette arbeidet var å utvikle en standardisert protokoll for å isolere og dyrke hASC med en komplett dyrefri metode, uten å endre cellefysiologi og stamhetsegenskaper sammenlignet med klassiske FBS-dyrkede hASCs (figur 1).

Protocol

hASCs ble isolert fra abdominalt fettvev hos en frisk kvinne som gjennomgikk brystrekonstruksjon ved hjelp av abdominale autologe (deep inferior epigastric perforator flaps, [DIEP]) ved universitetssykehuset i Lausanne, CHUV, Lausanne, Sveits. Den kasserte delen av og fettvevet ble innhentet etter at pasienten signerte informert samtykke. Alle protokoller ble gjennomgått og godkjent av sykehusets Biobank Department DAL (nummer 314 GGC) og etiske komiteer i henhold til Helsinkideklarasjonen. M…

Representative Results

Ved bruk av isolasjonsmetoden beskrevet ovenfor, ble hASCs vellykket oppnådd fra abdominale fettvevsprøver uten bruk av kollagenase. Videre ble hASCene utvidet i komplette xenogene frie forhold i nærvær av hPL og uten andre komponenter av animalsk opprinnelse. Følgende resultater støtter protokollen og er hentet fra hASC-er dyrket parallelt med hPL og med FBS som kontrollbetingelse. Etter det første klyngeutseendet viste hASC-ene den klassiske spindellignende formen og var mindre og len…

Discussion

Adipose-avledede stamceller har tiltrukket seg interessen for translasjonsforskning i det siste tiåret på grunn av deres overflod, raske og rimelige isolasjonsmetoder, høy in vitro / in vivo proliferasjonshastighet og stemness / differensieringsegenskaper^18,19,20. Som et resultat anses hASC som en utmerket kandidat for cellebaserte strategier innen regenerativ medisin²¹. Etter isoleri…

Materials

15 mL tubes	euroclone	et5015b
anti-CD105	BD Biosciences	BD560839
anti-CD34	BD Biosciences	BD555821
anti-CD45	BD Biosciences	BD555482
anti-CD73	BD Biosciences	BD561254
autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)	Miltenyi	130-091-222
BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)	BD accuri	–
Burker chamber	Blaubrand	717810
Cell freezing container	corning	CLS432002
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	G3582
CoolCell Freezing container	Corning	CLS432002
Cryovials	clearline	390701
Dimethyl sulfide	Sigma Aldrich	D2650-100mL
disposabile blade scalpel	paragon	bs 2982
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose	GIBCO	11965092
Human Platelet Lysate FD (GMP grade)	Stemulate	PL-NH-500
Infinite F50 spectrophotometer	Tecan	–
Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives	Olympus	CKX41
Petri dish 10 cm	Greiner bio-one	664160
Sterile scalpels	Reda	07104-00
Sterile scissors	Bochem	4071
Sterile tweezers	Bochem	1152
Swinging bucket centrifuge	Sigma	3-16K
T25 flasks	Greiner bio-one	6910170
TrypLe (animal free trypsin substitute)	GIBCO	12604-013