Aislamiento y cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo humano con un innovador método libre de xenogénicos para terapia humana
Summary
Los productos xenogénicos (químicos o derivados de animales) introducidos en los pasos de preparación/manipulación de la terapia celular se asocian con un mayor riesgo de reactividad inmune y transmisión patogénica en pacientes huéspedes. Aquí, se describe un método completo libre de xenogénicos para el aislamiento y la expansión in vitro de células madre derivadas de tejido adiposo humano.
Abstract
Teniendo en cuenta el creciente impacto de la terapia con células madre, se han planteado preocupaciones de bioseguridad con respecto a la posible contaminación o transmisión de infecciones debido a la introducción de productos derivados de animales durante la manipulación in vitro . Los componentes xenogénicos, como la colagenasa o el suero bovino fetal, comúnmente utilizados durante los pasos de aislamiento y expansión celular podrían estar asociados con los riesgos potenciales de reactividad inmune o infección viral, bacteriana y priónica en los pacientes receptores. Siguiendo las pautas de buenas prácticas de fabricación, se debe evitar la disociación química del tejido, mientras que el suero bovino fetal (FBS) puede sustituirse con suplementos libres de xenogénicos. Además, para garantizar la seguridad de los productos celulares, es importante definir métodos más fiables y reproducibles. Hemos desarrollado un método innovador, completamente libre de xenogénicos, para el aislamiento y la expansión in vitro de células madre derivadas de tejido adiposo humano sin alterar sus propiedades en comparación con los protocolos estándar de cultivo FBS de colagenasa. Aquí, las células madre derivadas de tejido adiposo humano (hASCs) se aislaron del tejido adiposo abdominal. La muestra se picó mecánicamente con tijeras/bisturí, se microdisecó y se dispersó mecánicamente en una placa de Petri de 10 cm, y se preparó con incisiones de bisturí para facilitar la unión de los fragmentos de tejido y la migración de hASCs. Siguiendo los pasos de lavado, se seleccionaron hASCs debido a su adherencia plástica sin digestión enzimática. Las hASCs aisladas se cultivaron con medio suplementado con lisado plaquetario humano libre de heparina al 5% y se separaron con un sustituto de tripsina libre de animales. Siguiendo las instrucciones de buenas prácticas de fabricación (GMP) sobre la producción de productos celulares destinados a la terapia humana, no se utilizaron antibióticos en ningún medio de cultivo.
Introduction
En las últimas décadas, la creciente demanda de tratamientos terapéuticos innovadores ha dado lugar a importantes esfuerzos e inversión de recursos en el campo de la medicina traslacional1. Los productos basados en células están asociados con riesgos determinados por la fuente celular, el proceso de fabricación (aislamiento, expansión o modificación genética) y los suplementos no celulares (enzimas, factores de crecimiento, suplementos de cultivo y antibióticos), y estos factores de riesgo dependen de la indicación terapéutica específica. La calidad, seguridad y eficacia del producto final podrían verse profundamente influenciadas por los elementos indicados anteriormente2. La terapia con células madre requiere la adhesión a los principios de bioseguridad; Los riesgos potenciales de transmisión patógena con productos derivados de animales en cultivo celular podrían ser problemáticos, y la prueba exhaustiva de cualquier producto introducido en la fabricación es esencial3.
El método tradicional para aislar células madre derivadas de tejido adiposo humano (hASCs) implica una digestión enzimática realizada con colagenasa seguida de pasos de lavado a través de centrifugación4. Si bien el aislamiento enzimático generalmente se considera más eficiente que otras técnicas mecánicas en términos de rendimiento celular y viabilidad, los componentes derivados de animales utilizados, como la colagenasa, se consideran más que mínimamente manipulados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos. Esto significa que existe un riesgo significativamente mayor de reacciones inmunes o transmisión de enfermedades, lo que limita la traducción de la terapia con hASC a entornos clínicos 5,6.
La digestión basada en tripsina es otro protocolo enzimático para aislar las ASC. Se han descrito diferentes técnicas con ligeras modificaciones en cuanto a la concentración de tripsina, velocidad de centrifugación y tiempo de incubación. Desafortunadamente, este método no está bien descrito, y existe una falta de comparación en la literatura, particularmente con los protocolos de aislamiento mecánico7. Sin embargo, en términos de la traducibilidad del enfoque, la tripsina tiene los mismos inconvenientes de la colagenasa.
Los métodos alternativos de aislamiento para obtener ASC, basados en fuerzas mecánicas y sin adición de enzimas, implican la centrifugación a alta velocidad (800 x g o 1.280 x g, 15 min) de los fragmentos de tejido adiposo. A continuación, el pellet se incuba con un tampón de lisis de glóbulos rojos (5 min), seguido de otro paso de centrifugación a 600 x g antes de la resuspensión en medio de cultivo. A pesar de un mayor número de células aisladas en los primeros días en comparación con los métodos de explante, un estudio previo mostró menor o ausencia de proliferación más allá de la segunda semana de cultivo8.
Además de eso, la manipulación adicional con medio xenogénico agregado, como el suero bovino fetal (FBS), que se utiliza como un suplemento de factor de crecimiento para cultivo celular, se asocia con un mayor riesgo de reactividad inmune y exposición a infecciones virales, bacterianas o priónicas del paciente huésped 9,10. Las reacciones inmunes y el desarrollo de erupción urticariforme ya se han descrito en individuos que reciben varias dosis de células madre mesenquimales producidas con FBS11. Además, FBS está sujeto a variabilidad de lote a lote, lo que puede tener un impacto en la calidad del producto final12.
De acuerdo con las directrices de buenas prácticas de fabricación (GMP), se debe evitar la disociación enzimática del tejido, y FBS debe sustituirse con suplementos libres de xenogénicos. Estos pasos, junto con protocolos más confiables y reproducibles, son esenciales para apoyar la aplicación de la terapia celular 3,13.
En este contexto, el lisado plaquetario humano (hPL) ha sido sugerido como un sustituto del FBS, ya que es un suplemento libre de células, que contiene proteínas, enriquecido con factor de crecimiento, y se introdujo anteriormente entre los productos basados en células de grado clínico como aditivo del medio de crecimiento para el cultivo y expansión celular in vitro 14,15. Como el hPL es un producto derivado del ser humano, se utiliza con frecuencia como sustituto del FBS durante el cultivo in vitro de hASCs destinadas a aplicaciones clínicas, reduciendo así los problemas relacionados con las reacciones inmunológicas y las infecciones relacionadas con la traducibilidad del FBS15,16.
A pesar de los mayores costos de producción, ya se ha demostrado que, en comparación con FBS, hPL apoya la viabilidad celular para muchos tipos de células, aumenta la proliferación, retrasa la senescencia, asegura la estabilidad genómica y conserva el inmunofenotipo celular incluso en pasajes celulares tardíos; Todos estos elementos apoyan el cambio hacia este suplemento cultural11.
El objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo estandarizado para aislar y cultivar hASCs con un método completo libre de animales, sin modificar la fisiología celular y las propiedades del tallo en comparación con las hASCs clásicas cultivadas con FBS (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Las células madre derivadas de tejido adiposo han atraído el interés de la investigación traslacional en la última década debido a su abundancia, métodos de aislamiento rápidos y asequibles, alta tasa de proliferación in vitro/in vivo y propiedades de tallo/diferenciación18,19,20. Como resultado, las hASCs son consideradas un excelente candidato para estrategias basadas en células en medicina regener…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores no tienen reconocimientos.
Materials
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | – | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | – | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
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