Störning av blod-ryggmärgsbarriären (BSCB) kan framgångsrikt uppnås med intravenös administrering av mikrobubblor och applicering av lågintensivt fokuserat ultraljud (LIFU). Detta protokoll beskriver öppnandet av BSCB med hjälp av LIFU i en gnagarmodell, inklusive utrustningsinställning, mikrobubbelinjektion, mållokalisering och BSCB-störningsvisualisering.
Lågintensivt fokuserat ultraljud (LIFU) använder ultraljudspulseringar med lägre intensitet än ultraljud och testas som en reversibel och exakt neuromodulerande teknik. Även om LIFU-medierad öppning av blod-hjärnbarriären (BBB) har undersökts i detalj, har ingen standardiserad teknik för öppning av blod-ryggmärgsbarriär (BSCB) hittills fastställts. Därför presenterar detta protokoll en metod för framgångsrik BSCB-störning med hjälp av LIFU-ultraljudsbehandling i en råttmodell, inklusive beskrivningar av djurförberedelser, administrering av mikrobubblor, målval och lokalisering, samt visualisering och bekräftelse av BSCB-störningar. Tillvägagångssättet som rapporteras här är särskilt användbart för forskare som behöver en snabb och kostnadseffektiv metod för att testa och bekräfta mållokalisering och exakt BSCB-störning i en smådjursmodell med en fokuserad ultraljudsgivare, utvärdera BSCB-effekten av ultraljudsbehandlingsparametrar, eller utforska tillämpningar för LIFU vid ryggmärgen, såsom läkemedelsleverans, immunmodulering och neuromodulering. Optimering av detta protokoll för individuell användning rekommenderas, särskilt för att främja framtida prekliniskt, kliniskt och translationellt arbete.
I likhet med blod-hjärnbarriären (BBB) reglerar blod-ryggmärgsbarriären (BSCB) rörelsen av cirkulerande lösta ämnen, celler och plasmakomponenter in i spinalparenkymet1. Denna skyddande egenskap är resultatet av ett specialiserat system av tätt bundna, icke-fenestrerade endotelceller som kantar ryggradens kapillärer2. Vanligtvis är det bara lipofila molekyler med låg vikt och positiv laddning som kan passera båda barriärerna3. Trots studier som tyder på att BSCB har en något högre permeabilitet än BBB, begränsar båda barriärerna leveransen av läkemedel till det centrala nervsystemet4. Flera strategier har utvecklats för att öka transporten av läkemedel över BSCB, inklusive tekniker för att öka osmotiskt tryck i ryggradens kapillärer, utveckling av läkemedel som interagerar med bradykininreceptorer och skapandet av funktionaliserade nanopartiklar5.
BSCB-störning kan också uppnås via intravenös administrering av mikrobubblor (MB) följt av lågintensivt fokuserat ultraljud (LIFU) ultraljudsbehandling6. Det akustiska fältet som genereras av ultraljudsgivaren orsakar MB-svängningar, som i sin tur belastar endotelväggen och lossar täta korsningar7. Den snäva korsningen som lossnar skapar övergående luckor i kapillärerna, vilket gör att läkemedel kan tränga in i spinalparenkymet (Figur 1). Denna process kan också skapa transendotelfenestrationer, öka transcytosen och nedreglera ATP-bindande kassetttransportörer, såsom P-glykoprotein 8,9. En viktig fördel med denna teknik är förmågan att minimera off-target effekter genom att rikta fokalområdet för ultraljudsbehandling till den plats av intresse i ryggmärgen. Flera kliniska prövningar har undersökt effekten av LIFU-medierad BBB-öppning för behandling av patologier i centrala nervsystemet, inklusive gliom, amyotrofisk lateralskleros, Alzheimers sjukdom och Parkinsons sjukdom. Även om LIFU-medierad BSCB-störning inte karakteriseras i lika stor utsträckning som LIFU-medierad BBB-störning, har flera grupper rapporterat framgångsrik BSCB-störning i gnagar-, kanin- och svinmodeller10,11,12. Sammantaget växer intresset för tekniken snabbt, särskilt som en gångbar väg för läkemedelstillförsel.
I detta protokoll beskrivs en teknik för LIFU-medierad BSCB-störning i en råttmodell. Proceduren inkluderar detaljerade beskrivningar av djurförberedelser, LIFU-utrustningsinställning, MB-administration, mållokalisering och ryggmärgsextraktion. Bekräftelse av mållokalisering och BSCB-störning utvärderas via Evans blue dye (EBD) extravasering i ryggmärgen. EBD är en giftfri förening som binder till serumalbumin och kan identifieras genom sin rika blå färg visuellt och röd autofluorescens under mikroskopi13.
Stegen som listas här erbjuder ett snabbt och billigt alternativ till traditionella ultraljud (US) eller magnetisk resonans (MR)-styrda LIFU-system. Som ett resultat är denna metod användbar för forskare som är intresserade av att snabbt testa och bekräfta inriktnings- och BSCB-störningsförmågan hos sin LIFU-givare innan de skaffar ytterligare utrustning och material eller bedriver LIFU-applikationer vid ryggmärgen, såsom läkemedelsleverans, immunmodulering och neuromodulering.
Här beskrivs den utrustning och de steg som krävs för effektiv och riktad BSCB-störning med hjälp av lågintensivt fokuserat ultraljud (LIFU) i kombination med administrering av mikrobubblor (MB). Detta protokoll är flexibelt och kan optimeras för individuell användning med givare med olika specifikationer. Andra tekniker för LIFU-medierad BSCB-störning förlitar sig på användningen av magnetisk resonanstomografi (MRI)-styrda system för mållokalisering, vilket är en dyr resurs16. Fördelarna med den teknik som presenteras här ligger i den snabba visuella bekräftelsen i realtid av BSCB-störningar och den enkla inriktningen på grund av förfarandets öppna karaktär. Dessutom är laserapparaten enkel att använda och konstruera, och en CAD-fil ingår i det kompletterande avsnittet. Som ett resultat kan forskare som är intresserade av att utföra inledande tester av inriktningsförmågan hos sin LIFU-givare i en smådjursmodell använda detta protokoll som ett verktyg för att snabbt bekräfta fokalzonspositionering över en plats av intresse. Denna teknik kan också användas av laboratorier som börjar studera kliniska tillämpningar av LIFU, såsom läkemedelstillförsel, innan de investerar i mer komplexa vägledningsmodaliteter som US- eller MR-system. För närvarande är USA-styrda modaliteter en mer lovande och kostnadseffektiv väg jämfört med MR-system, även om de senare oftare ses i litteraturen.
Det finns flera kritiska steg i denna procedur som måste utföras noggrant för att säkerställa en framgångsrik BSCB-störning. Det är absolut nödvändigt att undvika att lägga onödigt tryck på ryggmärgen under den kirurgiska laminektomin. För mycket fysisk manipulation av sladden ökar sannolikheten för skador på BSCB. Skadan visar sig som en mörkbrun fläck inuti strängen efter extraktion på grund av blödning och ökad EBD-extravasering. Dessutom måste maximal koppling säkerställas mellan givaren och den exponerade ryggmärgen. Som ett resultat måste man vara noga med att ta bort bubblor från vattenkonen och ultraljudsgelen. Det bör inte finnas några mellanrum mellan botten av vattenkonen och sladden för att säkerställa full överföring av den akustiska vågen. Under svansvenskateteriseringen bör man undvika att oavsiktligt släppa ut luft tillsammans med hepariniserad koksaltlösning, EBD eller MB-lösningar. Injektion av luft ökar kraftigt risken för lungemboli som leder till att gnagare dör innan ingreppet är avslutat28.
Ett vanligt problem som kan uppstå under denna procedur är att EBD-injektionen misslyckas. För personer med minimal erfarenhet av svansvenskateterisering kan det spara tid att utföra detta steg före djurens laminektomi, positionering eller inriktning. EBD kan också injiceras långt före MB injektion utan att påverka ultraljudsbehandling. Att använda den tourniquet och det varma vattenbad som föreslås i detta protokoll hjälper till att vidga svansvenerna och öka framgångsfrekvensen. Dessutom minskar uttorkning av råttor sannolikheten för korrekt kateterplacering. En intraperitoneal koksaltsinjektion 10-15 minuter före svansvenskateterisering kan hjälpa. Under kateteriseringen ska man börja 2 i ovanför svansens ände och röra sig i kaudal till kraniell riktning. Att röra sig i motsatt riktning minskar sannolikheten för framgång på grund av potentiell venkollaps eller blödning.
En annan vanlig utmaning är bristen på EBD-extravasering trots ultraljudsbehandling. Detta kan tyda på att de parametrar som används för ultraljudsbehandling är otillräckliga för BSCB-störningar. Till exempel, om ultraljudsbehandling frekvensen är inställd på ett värde som skiljer sig mycket från den centrala frekvensen av givaren, ultraljudsbehandling effekt kommer att vara för låg för att oscillera MB och orsaka tät korsning lossning. Dessutom, ju fler gränssnitt mellan givaren och sladden (t.ex. vattenkon, membran, gel, luftbubblor i vatten / gel), desto lägre är den verkliga ultraljudsbehandlingsintensiteten kommer att vara vid målet. Minimera dessa gränssnitt, till exempel genom att använda avgasad gel och noggrant ta bort bubblor inuti konen, kommer att hjälpa till att överföra den fulla potentialen av ultraljudsbehandling. Protokollet uppmuntrar också att öka tiden mellan ultraljudsbehandling och perfusion för att ge mer tid för EBD-extravasering i spinal parenkym. Även om BSCB-avbrott är en övergående procedur finns luckorna i flera timmar innan de stängs. En lång väntetid ökar exponeringen för isofluran, men resulterar också i större EBD-extravasering i strängen. Alternativt, EBD extravasering kan vara närvarande trots ingen ultraljudsbehandling med LIFU. För att felsöka detta problem måste försiktighet iakttas under laminektomin för att förhindra oavsiktlig skada på BSCB. Möjliga lösningar är att lyfta råttans ryggrad under fastspänning för att öka utrymmet mellan lamellerna och strängen, samt en kortare laminektomi. En grundlig PFA-perfusion minskar också bakgrundsfärgning genom att ta bort EBD-berikat blod från kärlen i ryggmärgen. Under den transkardiella perfusionen måste försiktighet iakttas för att förhindra oavsiktlig ruptur av hjärtat, vilket kan resultera i läckage av PBS eller PFA.
Det är viktigt att notera att denna studie representerar en enda centerupplevelse för LIFU-medierad BSCB-störning. Dessutom testar eller optimerar detta protokoll inte olika ultraljudsbehandling energi parametrar och MB koncentrationer. Som ett resultat uppmuntras forskare att undersöka olika parametrar och koncentrationer när de utför denna teknik för att optimera mållokalisering och BSCB-störningar för deras specifika forskningsbehov, särskilt om de första resultaten ger några negativa effekter. Grupper som inte vill se några temperaturförändringar kan till exempel testa olika parametrar tills de hittar en uppsättning som uppfyller detta kriterium och uppnår tillräcklig BSCB-störning. Dessutom kan ytterligare experiment utföras för att bekräfta säkerheten för denna teknik. Till exempel kan provstorleken ökas, överlevnadsperioden kan förlängas och elektromyografi/gånganalysstudier kan utföras. För längre överlevnad är det viktigt att komma ihåg att vissa studier visar att höga doser av EBD ibland kan orsaka kronisk systemisk toxicitet, så en lägre dos kan vara klok29.
En annan begränsning av denna procedur är den invasiva karaktären hos laminektomin (som krävs för alla tekniker som använder LIFU för BSCB-öppning eftersom ultraljud inte kan tränga igenom ben). Den invasiva karaktären hos denna procedur kan minskas genom att begränsa längden på laminektomin. Att utföra laminektomi i de övre bröstkotorna, som är kortare och tunnare, kan minska den tid som behövs för laminektomi till under 10 minuter. På grund av MBs ömtåliga natur, liksom deras korta halveringstid, är tiden begränsad under detta protokoll. Injektionen av MB bör ske 1-2 minuter före behandling med LIFU, och nya MB bör administreras före varje ultraljudsbehandling om flera LIFU-behandlingar utförs. För experiment som involverar BSCB-störning för flera råttor kan flera MB-injektionsflaskor behöva beredas. Eftersom mikrobubblor är dyra, ändra det kirurgiska arbetsflödet för att minimera tiden mellan ultraljudsbehandlingar är att föredra för att spara antalet MB som används.
Tekniken som beskrivs här är i första hand avsedd att användas som ett forskningsprotokoll. Även om lasermålsökningsapparaten inte kommer att ersätta traditionella målsökningsmetoder i alla kliniska miljöer, kan den vara användbar i andra situationer. För icke-invasiva operationer kan traditionella MRT-metoder användas på ett tillförlitligt sätt för att rikta in sig på30. För invasiva operationer som inkluderar en laminektomi som utförs, laserpunktsapparaten som beskrivs i detta protokoll kan användas för att snabbt lokalisera centrum av fokalzonen för ultraljudsbehandling över en specifik region (till exempel en tumör eller en plats för ryggmärgsskada) i syfte att leverera läkemedel eller immunmodulerande terapi samtidigt som man kompletterar eventuell MR-vägledning som skulle äga rum.
Sammantaget beskriver detta protokoll en effektiv och framgångsrik teknik för BSCB-störningar och innehåller flera alternativ för bekräftelse av BSCB-öppningen, både i realtid och efterbehandling. Eftersom BSCB fungerar som en barriär för inträde i ryggmärgsparenkymet är störning av BSCB en möjlig metod för att förbättra leveransen av terapier. Till exempel använde Weber-Adrian et al. LIFU med en frekvens på 1,114 MHz och burstlängd på 10 ms för att förmedla genleverans till halsryggraden6. På liknande sätt visade Smith et al. att LIFU med en frekvens på 580 kHz, genomsnittligt akustiskt topptryck runt 0,46 MPa och en burstlängd på 10 ms kunde hjälpa till att leverera en monoklonal antikropp, trastuzumab, till ryggmärgen i en gnagarmodell av leptomeningeala metastaser10. De flesta studier har fokuserat på att använda LIFU, snarare än HIFU, på grund av LIFU:s förmåga att tillfälligt permeabilisera BSCB samtidigt som man undviker skador på den underliggande vävnaden. Vanligtvis använder LIFU intensiteter mellan 0,125-3 W/cm 2, medan HIFU använder intensiteter från 100-10 000 W/cm2 eller högre31. Som ett resultat utövar HIFU sina effekter främst genom uppvärmning av vävnad, medan LIFU, med samadministrering av MB, arbetar genom mekaniska kavitationseffekter. Samtidig administrering av läkemedel med MB kan resultera i större extravasering av läkemedlet i spinalparenkymet, liksom potentialen att ladda MB med läkemedel och lysera MB med ultraljud för riktad läkemedelstillförsel.
Ultraljudsbehandling, MB-koncentration och typ av givare som används i denna studie kan ändras baserat på experimentella behov. Till exempel kan en givare med ett mindre fokusområde vara att föredra för experiment där större kontroll behövs över lokaliserad målinriktning, medan en givare med högre effekt kan användas för experiment som kräver kraftfull störning på kortare tid. På grund av den flexibilitet som detta protokoll erbjuder finns det stor potential för användning inom preklinisk, klinisk och translationell forskning.
The authors have nothing to disclose.
med stöd av T32GM136577 (D.R.); N660012024075 (N.T., N.V.T., A.M., K.K.L.); R01 HL139158-01A1 och R01 HL071568-15 (N.V.T.); Johns Hopkins ICTR Clinical Research Scholars Program (KL2) (AM). Flera figurer skapade med BioRender.com.
0.9% Heparinized Sodium Chloride | Baxter | FKB0953G | Flush tail vein catheter with heparinized saline to prevent clotting. |
100 mL Luer Lock Tip Syringe (2) | Wilburn Medical | WUSA/120 | One syringe can be used to inject PBS and one for PFA (during transcardial perfusion) |
1x Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 10010001 | For transcardial perfusion. |
22 G catheter | Med Vet International | 50-209-1694 | Use to place a tail vein catheter. |
97% Isoflurane | Thermo Scientific Chemicals | 247-897-7 | While rat is under isoflurane, be careful not to administer too much. A high dose can euthanize the rat. |
Betadine 7.5% | Purdue Products | 4677 | |
Class A clear threaded glass vial | Fisherbrand | 14-955-314 | Use to store spinal cord extraction. |
Digital balance scale | Kent Scientific | SCL-4000 | |
Electric razor | Wahl Home Products | 79449-200 | Shave fur off skin at incision site before surgery |
Eosin-Y with Phloxine | Epredia | 71304 | |
Evans blue dye | MP Biomedicals | 02151108-CF | Although it is non-toxic, it will stain skin blue if direct contact occurs. |
Fixation Plate Assembly with 0.5 mm Forceps | PSI Impactors | 7001-2 | Affix the stereotactic arm to this frame |
Gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | |
Heating pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
Hematoxylin | Epredia | 7211 | |
Iris Scissors with Angled Blades | ProDentUSA | 12-15315 | |
Isoflurane induction system | Kent Scientific | SOMNO-RATKIT | |
Laser targetting apparatus | NA | custom | CAD design file provided in supplemental section. Simply place a laser inside the apparatus created from the file. |
Lubricating eye ointment | Systane | N/A | |
Luer Lock 3-Way Stopcock | Sigma | SAS7521-10EA | Can use to fill water cone through inlet valve |
Lumason microbubbles kit | Bracco | 0270-7099-16 | |
Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
Microtome | Epredia | 23-900-671 | |
Mounting medium with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-2000-2 | |
Mylar membrane | Chemplex | 3016 | Can cut membrane to appropriate size if too large for cone |
NeuroFUS 2.52" diameter 250 kHz transducer | Sonic Concepts | CTX-250 | Transducer system includes custom water cone and probe holder |
NeuroFUS PRO v2.0 system | Sonic Concepts | NFS102v2 | Includes Transducer Power Output, Matching Network and associated cables |
Offset Bone Nippers | Fine Science Tools | 16101-10 | Use to remove spinous processes and laminae for laminectomy |
Paraffin | Polysciences | 24364-1 | Can place spinal cord sample in paraffin to slice into thin sections for histology. |
Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J61899-AK | For transcardial perfusion. |
Rat Surgical Kit | Kent Scientific | INSRATKIT | Consists of tweezer #5, needle holder, McPherson-Vannas scissors, Iris scissors, ALM self-retaining retractors, Iris forceps, and blunt probe. These products should be sufficient to perform a laminectomy. |
Razor blade | Fisherbrand | 12-640 | Use to cut spinal cord extraction to desirable length and split section down midline. |
Rectal thermometer | Kent Scientific | RET-2 | Maintain rat temperature between 35.9–37.5 °C |
Rubber band | Fisherbrand | 50-205-1983 | |
Single animal vaporizer unit | Kent Scientific | SF-01 | |
Stereotactic arm | Kopf Instruments | Model 963 | |
Sterile absorbent pad | McKesson | 4033-CS150 | Place under rat and above heating pad and fixation plate before laminectomy |
Ultrasound gel | Aquasonic | PLI 01-34 | Ensure gel is free of bubbles to the best of your ability. |