Her presenterer vi en protokoll for bruk av et høykapasitetssystem som muliggjør overvåking og kvantifisering av nevromodulerende effekter av fokusert ultralyd på menneskeinduserte pluripotente stamcellenevroner (HiPSC).
De nevromodulerende effektene av fokusert ultralyd (FUS) har blitt demonstrert i dyremodeller, og FUS har blitt brukt med hell til å behandle bevegelse og psykiatriske lidelser hos mennesker. Til tross for suksessen til FUS, er mekanismen som ligger til grunn for dens effekter på nevroner fortsatt dårlig forstått, noe som gjør behandlingsoptimalisering ved å justere FUS-parametere vanskelig. For å løse dette kunnskapsgapet studerte vi menneskelige nevroner in vitro ved bruk av nevroner dyrket fra menneskeskapte pluripotente stamceller (HiPSCs). Bruk av HiPSCs muliggjør studier av menneskespesifikk nevronatferd i både fysiologiske og patologiske tilstander. Denne rapporten presenterer en protokoll for bruk av et system med høy gjennomstrømning som muliggjør overvåking og kvantifisering av de nevromodulerende effektene av FUS på HiPSC-nevroner. Ved å variere FUS-parametrene og manipulere HiPSC-nevronene gjennom farmasøytiske og genetiske modifikasjoner, kan forskere evaluere nevrale responser og belyse de nevromodulerende effektene av FUS på HiPSC-nevroner. Denne forskningen kan ha betydelige implikasjoner for utviklingen av sikre og effektive FUS-baserte terapier for en rekke nevrologiske og psykiatriske lidelser.
Fokusert ultralyd (FUS) er en lovende nevromodulasjonsmodalitet som muliggjør ikke-invasiv stimulering på centimeternivå dybder med sub-millimeter oppløsning 1,2,3. Til tross for disse styrkene er den kliniske effekten av FUS begrenset, delvis på grunn av mangel på kunnskap om virkningsmekanismen. Uten et solid teoretisk fundament står forskere og klinikere overfor vanskeligheter med å skreddersy terapien for å møte de spesifikke behovene til individuelle pasienter under varierende forhold. En fremtredende teori foreslått av Yoo et al.4 antyder at mekanosensitive ionkanaler er ansvarlige for nevronaktivering. Denne teorien klarer imidlertid ikke å forklare FUS-aktivering i menneskelige hjerneneuroner, som mangler disse kanalene5. Denne tvetydigheten begrenser bruken av FUS i klinikken, da det utelukker justering av FUS-parametere for å optimalisere behandlingsresultatene.
Tidligere relaterte studier har benyttet en rekke tilnærminger for å undersøke de fysiologiske mekanismene som ligger til grunn for FUS og for å bestemme de optimale stimuleringsparametrene. Et avgjørende skritt i denne prosessen innebærer overvåking av nevronresponser som tilbakemelding, som kan oppnås gjennom metoder som involverer ionportovervåking, for eksempel kalsiumionavbildning4, optisk avbildning1 og ex vivo elektrofysiologisk opptak (f.eks. elektromyografi6 eller hudnerveelektrofysiologi7). Imidlertid bruker de fleste av disse studiene ikke-menneskelige nevroner eller in vivo-tilnærminger, noe som kan introdusere ytterligere avvik på grunn av suboptimale kontroller. I motsetning til dette gir bruk av elektroder for å måle nevronsignaler i in vitro menneskeinduserte pluripotente stamcellenevroner (HiPSC) mer følsomme målinger og større kontroll over det eksperimentelle miljøet. I dette arbeidet har et in vitro-system blitt utviklet ved hjelp av mikroelektrodearrays (MEAs) for å måle de elektriske responsene til HiPSC-nevroner etter FUS-stimulering, som vist i figur 1. Dette systemet gir forskere i samfunnet mulighet til å overvåke nevronresponser når de varierer ultralydparametrene (f.eks. Frekvens, burstlengde, intensitet). I tillegg muliggjør dette systemet et høyt nivå av kontroll over nevronens følsomhet for fysiske stimuli (f.eks. temperatur, trykk og kavitasjon)8,9, da nevronenes ionkanalfunksjonalitet kan manipuleres genetisk og farmasøytisk (f.eks. ved bruk av gadolinium for å hemme ionekanaler)10,11,12. Denne molekylære nivåkontrollen kan bidra til å belyse mekanismene bak de nevromodulerende effektene av FUS.
Dette manuskriptet beskriver en ny metode som kan brukes til å registrere nevronaktivitet i HiPSCs under FUS-nevromodulering. Denne protokollen er generaliserbar til forskjellige FUS-transdusere og MEA-systemer. For å replikere resultatene observert med den beskrevne protokollen, bør forskeren sørge for at transduserens fokuspunkt er større enn området på bunnen av MEA-brønnen. Videre, hvis forskjellige nevroncellelinjer brukes, må filterparametrene være innstilt på den forventede frekvensresponsen for cellene i brønnen. Hvis representative resultater ikke kan oppnås, bør man vurdere å endre de nevnte parametrene (f.eks. burst lengde, intensitet, driftssyklus, etc.).
Selv om dette arbeidet viste en økning i avfyringshastigheten etter FUS-stimulering, må flere data samles inn for å demonstrere repeterbarheten av dette funnet før noen konklusjoner trekkes. Denne protokollen arver begrensningene til MEA-systemer, som vanligvis har svakheter som stammer fra signalregistreringen med direkte mikroelektrodestrøm. Selv om direkte kontakt med nevronet gir bedre følsomhet, kan det endre cellen og påvirke målenøyaktigheten. Videre, på grunn av den lille størrelsen på brønnene, inkluderer systemet vårt ikke perifert vev, som også kan spille en rolle i nevromodulering17. Dette kan begrense anvendeligheten av konklusjoner trukket fra dette oppsettet til in vivo-miljøer . For å studere mer komplekse nettverksresponser, må et MEA-system med høyere kanaltetthet utformes for å forbedre følsomheten18. Flere fremtidige retninger for dette foreslåtte systemet er identifisert, inkludert bruk av en 3D-portal for å holde transduseren og sikre nøyaktig plassering19. Ytterligere forbedringer kan gjøres angående etterbehandlingsalgoritmen, inkludert bruk av en spiking sorteringsalgoritme20 for å klassifisere individuelle nevroner. Denne prosessen vil være gunstig for å disentangling responsene til multi-enhet nevroner i fremtidige studier på mekanismene til FUS. Viktigst av alt er det viktig å innlemme ytterligere stimuleringsmodaliteter, for eksempel kjemiske, elektriske og optiske stimuli, for å belyse de underliggende mekanismene. Disse metodene kan endre nevronegenskaper og atferd, for eksempel ved å hemme spesifikke ionkanaler15 eller modifisere membranegenskapene21. Ved å modulere hovedfaktorene innenfor den hypotetiske signalveien, kan forskere identifisere bidragene fra hver faktor i kontrollerte miljøer og til slutt kaste lys over de komplekse interaksjonene som spilles.
Elektrisk stimulering22 er en av de mest etablerte teknikkene for nevromodulering, med en lang historie med vellykkede applikasjoner i kliniske og forskningsinnstillinger. I motsetning til dette er FUS og optogenetikk23 relativt nye modaliteter som har fått oppmerksomhet de siste årene. De største fordelene ved FUS er dens ikke-invasivitet og evne til å stimulere nevroner på dybder som kan være vanskelig å nå med andre teknikker, inkludert elektrisk stimulering og optogenetikk. Imidlertid, som optogenetikk24, har FUS noen begrensninger knyttet til modellering av bølgeutbredelsen og tilhørende nevronresponser. Å fange kompleksiteten til vevets heterogene akustiske egenskaper in vivo kan være utfordrende, noe som fører til usikkerhet i trykkfeltet og følgelig i nevronresponsene. Denne vanskeligheten med nøyaktig modellering av disse egenskapene gir en utfordring når man optimaliserer teknikken for spesifikke virkelige applikasjoner. Den iboende kompleksiteten understreker viktigheten av in vitro-systemer som den i denne studien, da de muliggjør direkte studier av responser under kontrollerte akustiske intensitetsforhold.
Avslutningsvis gir dette systemet en høy gjennomstrømning, in vitro-plattform for å studere nevromodulerende effekter av FUS på humane nevroner. Med dette systemet kan virkningsmekanismene til FUS utforskes ved å måle de elektriske responsene fra menneskelige nevroner når de utsettes for varierende nivåer og typer stimulering i et kontrollert miljø. Derfor tilbyr den et verdifullt tilleggsverktøy til menneske- og dyremodellene som vanligvis brukes i feltet.
The authors have nothing to disclose.
Amir Manbachi og Nitish Thakor anerkjenner finansieringsstøtte fra Defense Advanced Research Projects Agency, DARPA, Award Contract: N660012024075. I tillegg anerkjenner Amir Manbachi finansieringsstøtte fra Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research (ICTR) Clinical Research Scholars Program (KL2), administrert av National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), National Institutes of Health (NIH). Nitish Thakor anerkjenner finansieringsstøtte fra National Institutes of Health (NIH): R01 HL139158-01A1 og R01 HL071568-15.
MEA System | Axion Biosystem Inc. | Maestro Edge | Sampling Rate: 11500 Hz |
MEA Plate | Axion Biosystem Inc. | CytoView MEA | Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells |
Well plate Interface | Amcor Inc. | Parafilm PM996; P7793 | Thickness: 127 µm |
CO2 Tank and Regulator for culture | AirGas Inc./ Harris Inc. | 9296NC | Concentration: 5% |
Culture Media | ThermoFisher Inc. | Laminin; 23017-015 | Concentration: 1 µg/mL |
HiPSC Neurons | Peprotech | CIPS and GM01582 Derived; 450-10 | Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13) |
Transducer | Sonic Concepts Inc. | CTX250; 008 | Center Frequency: 250 kHz |
Matching Network | Sonic Concepts Inc. | CTX250; NFS102v2 | Impedance: 50 Ω |
Transducer Power Output (TPO) | Sonic Concepts Inc. | Version 4.1; 020 | Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz |
Membrane | McMaster Inc. | Silicone Rubber; 5542N115 | Thickness: 0.0127 cm |
Coupling Gel | Parker Laboratory Inc. | Aquasonic 100; B08DDWG GXB | Viscosity: 130,000–185,000 cops |
Connection to Probe holder | McMaster Inc. | Steal Threaded Rod; 90322A661 | Length: 1–1/2" Long |
Centrifuge | ThermoFisher Inc. | Sorvall Legend X1R; 75004261 | Max acceleration: 10–25,830 x g |
Hydrophone | Sonic Concepts Inc. | Y-104; 009 | Range: 50 kHz–1.9 MHz |
Water Tank | Sonic Concepts Inc. | WT | Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm |
Water Conditioning Unit | Sonic Concepts Inc. | WCU; SN006 | Flow Velocity: 50 mL/s maximum |
Oscilloscope | Rohde-Schwarz Inc. | RTC1002 | Sampling rate: Up to 50 MHz |
Stage | Sonic Concepts Inc. | MicroStage; 2 | Accuracy: 1 µm |
Thermochromic sheet | TIPTEMP Inc. | Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337 | Range: 22–24 °C |
Computer | Microsoft Surface | Surface Pro | CPU i5 1035G4: 3.7 GHz |
Data Transfer Software | Mathworks Inc. | MATLAB | Version 2021b |
Processing Software | Python Software Foundation | Python | Version 3.7.10 |