Fokuserad ultraljudsneuromodulering av humana in vitro neurala kulturer i mikroelektrodmatriser med flera brunnar

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att använda ett system med hög genomströmning som möjliggör övervakning och kvantifiering av de neuromodulerande effekterna av fokuserat ultraljud på humant inducerade pluripotenta stamcellsneuroner (HiPSC).

Abstract

De neuromodulerande effekterna av fokuserat ultraljud (FUS) har visats i djurmodeller, och FUS har använts framgångsrikt för att behandla rörelse och psykiatriska störningar hos människor. Men trots framgången med FUS är mekanismen bakom dess effekter på nervceller fortfarande dåligt förstådd, vilket gör det svårt att optimera behandlingen genom att justera FUS-parametrarna. För att ta itu med denna kunskapslucka studerade vi humana nervceller in vitro med hjälp av nervceller odlade från humaninducerade pluripotenta stamceller (HiPSCs). Genom att använda HiPSCs kan man studera människospecifika neuronala beteenden i både fysiologiska och patologiska tillstånd. Denna rapport presenterar ett protokoll för att använda ett system med hög genomströmning som möjliggör övervakning och kvantifiering av de neuromodulerande effekterna av FUS på HiPSC-neuroner. Genom att variera FUS-parametrarna och manipulera HiPSC-neuronerna genom farmaceutiska och genetiska modifieringar kan forskare utvärdera de neurala svaren och belysa de neuromodulerande effekterna av FUS på HiPSC-neuroner. Denna forskning kan få betydande konsekvenser för utvecklingen av säkra och effektiva FUS-baserade terapier för en rad neurologiska och psykiatriska störningar.

Introduction

Fokuserat ultraljud (FUS) är en lovande neuromoduleringsmodalitet som möjliggör icke-invasiv stimulering på centimeternivå djup med submillimeterupplösning ^1,2,3. Trots dessa styrkor är den kliniska effekten av FUS begränsad, delvis på grund av bristande kunskap om dess verkningsmekanism. Utan en solid teoretisk grund har forskare och kliniker svårt att skräddarsy behandlingen för att möta de specifika behoven hos enskilda patienter under olika förhållanden. En framträdande teori som föreslagits av Yoo et ^al.4 föreslår att mekanokänsliga jonkanaler är ansvariga för neuronaktivering. Denna teori misslyckas dock med att förklara FUS-aktivering i mänskliga hjärnneuroner, som saknar dessa kanaler⁵. Denna tvetydighet begränsar användningen av FUS i kliniken, eftersom den utesluter justering av FUS-parametrar för att optimera behandlingsresultaten.

Tidigare relaterade studier har använt en rad olika metoder för att undersöka de fysiologiska mekanismer som ligger till grund för FUS och för att bestämma de optimala stimuleringsparametrarna. Ett avgörande steg i denna process involverar övervakning av neuronala svar som återkoppling, vilket kan uppnås genom metoder som involverar jon-gate-övervakning, såsom kalciumjonavbildning⁴, optisk avbildning¹ och ex vivo elektrofysiologisk registrering (t.ex. elektromyografi⁶ eller hud-nervelektrofysiologi⁷). De flesta av dessa studier använder dock icke-mänskliga neuroner eller in vivo-metoder, vilket kan introducera ytterligare variationer på grund av suboptimala kontroller. Att däremot använda elektroder för att mäta neuronala signaler i in vitro human-inducerade pluripotenta stamcellsneuroner (HiPSC) ger känsligare mätningar och större kontroll över den experimentella miljön. I detta arbete har ett in vitro-system utvecklats med hjälp av mikroelektrodmatriser (MEA) för att mäta de elektriska svaren hos HiPSC-neuroner efter FUS-stimulering, som visas i figur 1. Detta system gör det möjligt för forskare i samhället att övervaka neuronala svar när man varierar ultraljudsparametrarna (t.ex. frekvens, burstlängd, intensitet). Dessutom möjliggör detta system en hög nivå av kontroll av neuronal känslighet för fysiska stimuli (t.ex. temperatur, tryck och kavitation)^8,9, eftersom neuronernas jonkanalfunktionalitet kan manipuleras genetiskt och farmaceutiskt (t.ex. genom att använda gadolinium för att hämma jonkanaler)10,11,12. Denna kontroll på molekylär nivå kan bidra till att belysa mekanismerna bakom de neuromodulerande effekterna av FUS.

Protocol

1. Beredning av material Aspirera odlingsmediet och använd det för att fylla en enda brunn i en 24-brunnars neuronodlingsplatta med inbäddad MEA (figur 2A). Odla och inducera neuronerna enligt det publicerade protokollet av Taga et al.13. Sterilisera parafilmgränssnittet, gummibandet och FUS-konen med dess gummimembran med 70 % etanol i 10 minuter och placera dem i dragskåpet för senare montering. Avgasa 300 ml avjoniserat vatten och 50 ml kopplingsgel. Centrifugera vattnet och gelen vid 160 x g i 5 minuter för att undvika kavitation i kopplingsmediet.OBS: Den ursprungliga källan till HiPSCs är från GM01582- och CIPS-cellinjer. I genomsnitt kan en densitet på 5 x 104 motorneuroner och 2,5 x 104 astrocyter per brunn uppnås14. 2. Anslutning och installation av kringutrustning Fäst FUS-konen på givaren med skruvar och försegla konen med ett flexibelt gummimembran i en ventilerad steril huv. Fyll konen med avgasat och avjoniserat (DG-DI) vatten från steg 1.3 och se till att det inte finns några bubblor i konen för att undvika kavitation. Använd en anpassad gängstång för att fästa den 3D-printade hållaren på en ram (Figur 2B). Placera ramen så att huvudet på FUS-givaren är över brunnen som kommer att stimuleras. Använd ett gummiband för att fästa parafilm över brunnen på 24-håls MEA-plattan som innehåller mediet och HiPSC. Förbered FUS-systemet genom att ansluta ultraljudsgivarens back-end-drivrutinselektronik, i detta fall givarens uteffekt (TPO; Figur 3A), till ett 100-240 V eluttag (Figur 3B, Anslutning 6) och ansluta det matchande nätverket till TPO och FUS-givaren (Figur 3B, Anslutning 1 respektive Anslutning 2). Det matchande nätverket säkerställer effektiv elektrisk koppling mellan givaren och TPO:n. Anslut MEA-systemet till ett eluttag (100-240 V) (Figur 3B, Anslutning 5). Anslut MEA-systemets synkroniseringsport till TPO:n (Figur 3B, Anslutning 3). Denna anslutning kommer att synkronisera datainsamlingen av MEA-systemet med FUS-stimuleringen. Placera 24-håls MEA-plattan i MEA-systemet och ta bort locket för att möjliggöra direktkontakt mellan givaren och brunnen. Placera givaren 5-10 mm ovanför brunnsplattan för att ge plats för avgasningsgelen, enligt beskrivningen i steg 3.2 (Figur 3A och Figur 2B). 3. Stimulering och neuronal signalinsamling Ställ in FUS-parametrarna på TPO-kontrollpanelen (tabell 1). Applicera kopplingsgelen ovanpå parafilmen och sänk ner FUS-givaren i kopplingsgelen, se till att den kommer i kontakt med gelen med minimala luftbubblor (Figur 2A). Starta MEA-systeminspelningen genom att klicka på Start-knappen i användargränssnittet. Starta FUS ultraljudsbehandling genom att trycka på den nedre högra knappen på TPO (Figur 3A, Etikett 7), och vänta minst 5 minuter mellan varje omgång av ultraljudsbehandling så att neuronerna kan återgå till ett baslinjetillstånd. Använd triggerpulsen som genereras av FUS-systemet för att anpassa FUS-stimuleringssekvensen till MEA-inspelningen (Figur 3B, anslutning 3). 4. Databehandling och analys Överför data från MEA-systemet till datorn med en USB-anslutning (bild 3B, anslutning 4). Starta detta genom att klicka på panelen Experimentkonfiguration . Välj sedan den datatyp man vill spela in. I det här fallet rekommenderas råa spikar. Namnge slutligen filen och välj önskad plats på hårddisken för att slutföra överföringen.Följande steg kan utföras genom att köra det utgivna Python-skriptet i https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod. Läs in data från var och en av de 16 elektroderna. Använd ett Butterworth-bandpassfilter med en bandbredd på 5 Hz till 3 kHz med en Butterworth-ordning på 8.OBS: För att optimera dessa värden är det viktigt att ta hänsyn till avfyrningshastigheten för de specifika cellerna och antalet celler som är inblandade. Genom att multiplicera dessa 2 värden kan man uppskatta den totala avfyrningshastigheten för cellpopulationen i experimentet. Använd ett Gaussiskt filter med σ = 3 för att jämna ut signalen.OBS: Parametern kan optimeras baserat på de rekommenderade värdena från MEA-systemet, eftersom överdriven utjämning kan resultera i dataförvrängning efter förvärvet, och för lite utjämning skulle introducera oönskat brus. Ställ in ett tröskelvärde för att detektera de potentiella topparna som 5 gånger standardavvikelsen för den Gaussiska utjämnade signalen. Beräkna avfyrningshastigheten genom att dividera antalet spikar som registrerats i ett 50 ms-fönster över alla 16 kanaler med fönstrets längd (dvs. 50 ms). Flytta fönstret längs signalen till nästa bildruta och upprepa beräkningen av avfyrningshastigheten (kompletterande figur 1). Analysera signalen genom att läsa FUS ultraljudsbehandling tid från överförda data baserat på förändringen i avfyrningshastigheten i samband med FUS. 5. Rengöring och återanvändning av MEA-plattor med flera brunnar När experimenten är klara, använd en pipett för att försiktigt ta bort mediet från brunnarna i flerbrunnsplattan, var noga med att undvika elektrodytan. Tillsätt 2 ml DG-DI-vatten per brunn. Aspirera och upprepa en gång. För att få bort eventuella celler och skräp, tillsätt en blandning av 1 g enzymatiskt rengöringsmedel Terg-A-Zyme med 10 ml sterilt DG-DI-vatten (0,3 ml per brunn) till plattan. Låt den inkubera över natten i rumstemperatur (RT). Följande dag tar du bort lösningen från brunnarna och sköljer dem med 1 ml sterilt DG-DI-vatten. Inkubera flerbrunnsplattan i 5-7 minuter och aspirera. Upprepa detta steg 5 gånger. Tillsätt 0,5 ml sterilt DG-DI-vatten per brunn. Anteckna baslinjen för den rengjorda flerbrunnsplattan för att bekräfta att MEA-plattan är ren. En rengjord platta bör uppvisa gaussiska brusmönster med låga intensitetsvärden. Förvara den rengjorda flerbrunnsplattan vid 4 °C tills den är redo att användas igen. Byt vatten som MEA lagras i minst en gång i månaden.

Representative Results

Sammanfattningsvis presenterar vi ett protokoll som möjliggör in vitro övervakning av FUS neuromodulering med hjälp av neuroner odlade från HiPSCs. Den övergripande systemplattformen för att stimulera HiPSC-inducerade neuroner och registrera motsvarande elektriska svar för analys beskrivs i figur 1. Denna studie fokuserar på FUS-stimulering av neuroner och registrering av de elektriska svaren i ett MEA-system, som visas i figur 2. De perifera komponenterna i FUS- och MEA-systemen och deras anslutningar illustreras i figur 3. Karakteriseringen av fokalpunkten utförs före neuronalexperimenten för att säkerställa att brunnens botten är helt täckt av FUS-brännpunkten. Visualiseringen av brännpunkten på termokroma plattor, som visas i figur 4, bör utföras för att utvärdera FUS-systemet. Efter karakterisering av fokalpunkten bör efterbehandlingsstegen, inklusive filtrering, trösklar och beräkning av avfyrningshastigheten, utföras, och dessa sammanfattas i figur 5 och figur 6. Dessa steg är viktiga för att hämta användbara signaler genom att filtrera brus från omgivningen och därmed få insikt i de neuronala aktivitetsförändringar som orsakas av FUS. Rasterdiagrammen i figur 6A-B visar de upptäckta spikarna i varje kanal. Eftersom hela brunnens botten ligger inom FUS-givarens brännpunkt, förväntas det att FUS ska ändra avfyrningshastigheten över alla elektroder. Denna förändring i avfyrningshastighet visualiseras i avfyrningshastighetsdiagrammet som visas i figur 6C, som visar att de valda stimuleringsparametrarna resulterade i en ökning av den neuronala avfyrningshastigheten. Närmare bestämt var avfyrningshastigheten före FUS (dvs. baslinjen) 140 Hz ± 116,7 Hz, medan avfyrningshastigheten efter FUS var 786 Hz ± 419,4 Hz med kontinuerlig våg FUS. Dessutom visar figur 6C hur ändring av FUS-parametrarna (t.ex. användning av pulsad våg FUS istället för kontinuerlig våg) kan ändra storleken på förändringen i avfyrningshastigheten, samt ändra hur lång tid det tar innan neuronerna återgår till sitt baslinjetillstånd. Lågintensivt fokuserat ultraljud (LIFU) orsakar inte signifikant uppvärmning av kulturer, särskilt jämfört med högintensivt fokuserat ultraljud, som syftar till att uppnå termisk skada. Avsaknaden av kliniskt påverkande temperaturförändringar stöds av teoretiska beräkningar och simuleringar (kompletterande figur 2). Även i extrema fall av de experimentella FUS-parametrar som anges i tabell 1 kunde endast en minimal temperaturökning observeras på cirka 0,04 °C. Användningen av ett diagram över avfyrningshastighet gör det möjligt att kvantifiera de neuromodulerande effekterna av FUS och kan användas för att skilja mellan excitatoriska och hämmande svar. En betydande fördel med MEA-plattan med flera brunnar är att den kan återanvändas flera gånger för att studera olika neuronala tillstånd och stimuleringsparametrar på ett sätt med hög genomströmning. Figur 1: Översikt över in vitro-plattformen för fokuserad ultraljudsneuromodulering (FUS) av neuroner i en brunn och mätning av deras neuronala aktivitet med hjälp av en mikroelektrodmatris. Varje elektrod (röda, gröna och blå linjer) registrerar från en population av neuroner i en enda brunn. En bearbetningspipeline implementeras för att omvandla de råa neuronala elektriska inspelningarna till detektion av neuronala avfyrningsmönster. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 2: FUS-neuromodulering med en mikroelektrodmatris med flera brunnar (MEA). (A) Schematisk inställning för FUS-neuromodulering med en MEA med flera brunnar. De akustiska vågorna som genereras av FUS-givaren fortplantar sig genom en FUS-kon fylld med avgasat vatten och kopplas ihop med hjälp av ultraljudsgel. Parafilmen fästs i brunnen med hjälp av ett gummiband för att förhindra kontaminering. MEA-plattan skickar elektriska inspelningar från neuronerna till MEA-systemet. (B) Ett fotografi av FUS-givaren på flerbrunnsplattan som ingår i MEA-systemet. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 3: In vitro-plattformens uppbyggnad. (A) Framsidan av in vitro-plattformens uppställning. Givarens uteffekt (TPO; vänster) används för att programmera FUS-parametrarna. MEA-systemet (till höger) registrerar elektrisk aktivitet från neuronerna i brunnsplattan, som neuromoduleras av FUS-givaren. (B) Baksidan av in vitro-plattformen med anslutningar från det matchande nätverket (1) till TPO och (2) till givaren. (3) Anslutningen från MEA-systemet till TPO synkroniserar datainsamlingen. (4) Anslutning från MEA-systemet till datorn för dataöverföring. (5) Strömanslutningen till MEA-systemet. (6) Strömanslutningen till FUS-systemet. (7) Knappen för ultraljudsbehandling. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 4: Karakterisering av FUS-givaren. A) En tryckkarta över brännpunkten med hjälp av de FUS-parametrar som anges i tabell 1 och som uppmätts med AMPLITUDE-systemet15. (B) Pre- och post-ultraljudsbehandling av ett termokromt ark placerat på botten av en brunn med hjälp av den experimentella uppställningen som visas i figur 3. Det termokroma arket ändrar färg som svar på temperaturförändringar, vilket ger en visuell validering av framgångsrik stimulering på neuronernas plats. Den maximala rumsliga topppulsmedelintensiteten (ISPPA) på 30 W/cm2 och kontinuerlig ultraljudsbehandling på 3 min justerades för att ändra den lokala temperaturen drastiskt för bättre visualisering av en sådan brännpunkt. Klicka här för att se en större version av denna figur. Bild 5: Bearbetningspipeline. steg 1: Råa elektriska inspelningar fångas från N = 16 kanaler. De framtida stegen visar processen med kanal 16 (markerad i rött). Steg 2: För varje kanal appliceras ett Butterworth-bandpassfilter (5 Hz till 3 kHz bandpass), följt av ett Gaussiskt filter (σ = 3). En tröskel är inställd som fem gånger standardavvikelsen för signalen inom ett 2 s fönster centrerat i början av ultraljudsbehandlingen. Steg 3: Signaler över eller under tröskeln karakteriseras som spikar. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 6: Raster- och avfyrningshastighetsdiagram. (A) Rasterdiagram över de detekterade spikarna vid varje kanal som en funktion av ultraljudsbehandlingstiden. Tiden för FUS-stimulering kommenteras med en röd linje. (B) Rasterdiagram över neuroner under olika FUS-inställningar med kontinuerlig FUS för jämförelse. (C) Eldhastigheten beräknades med hjälp av ett glidfönster på 50 ms. Den genomsnittliga avfyrningshastigheten före och efter FUS neuromodulationer var 140 Hz respektive 786 Hz. Med pulsad FUS var de genomsnittliga avfyrningshastigheterna 230 Hz och 540 Hz. En kortare aktivering och mindre hastighetsförändring observerades induceras av denna uppsättning av varierande FUS-stimulering. Processen för att beräkna eldhastigheten beskrivs i kompletterande figur 1. Klicka här för att se en större version av denna figur. Parameter Värde Max effekt/ch. 1.200 W P faktiska 0,749 W/kanal. JagSPPA 10.79 W/cm2 ISPTA 0,05 W/cm2 Burst-längd 0,100 ms Frekvens 250,00 kHz Fokus 39.800 mm Period 20.000 ms Timer 60.000 s Tabell 1: Parametrar för fokuserat ultraljud (FUS) som ställts in på TPO för studien som presenteras i figur 4. Kompletterande figur 1: Bearbetning från rasterdiagrammet till eldhastigheten. Steg 1: Räkna topparna bland alla kanaler för att få räkningsnumret inom ett givet skjutfönster. Notera: Här valdes ett större skjutfönster (inställt på 0,1 s) för bättre illustration. Steg 2: Konvertera topparna per fönsterlängd till toppar per sekund (t.ex. multiplicera här antalet med 10 för att konvertera till hertz [Hz] och dividera sedan med 1 000 för att få värdet i kilohertz [kHz]). Steg 3: Eldhastighetskurvan som förvärvas som ett resultat. En verktygslåda med öppen källkod, tillsammans med exempeldata, finns på GitHub (https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod). Klicka här för att ladda ner den här filen. Kompletterande figur 2: K-vågssimuleringsresultat temperaturprofil för LIFU16. Baserat på den akustiska intensitetskartan som visas i figur 4 tyder K-vågssimuleringsresultatet på en maximal temperaturökning på 0,04 °C inom fokalzonens mittområde (radie: 2 mm) med hjälp av extremfallet för de experimentella FUS-parametrarna som anges i tabell 1. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Detta manuskript beskriver en ny metod som kan användas för att registrera neuronal aktivitet i HiPSCs under FUS neuromodulering. Detta protokoll är generaliserbart till olika FUS-givare och MEA-system. För att replikera de observerade resultaten med det beskrivna protokollet bör forskaren se till att givarens brännpunkt är större än arean på botten av MEA-brunnen. Dessutom, om olika neuronala cellinjer används, måste filterparametrarna ställas in på det förväntade frekvenssvaret för cellerna i brunnen. Om representativa resultat inte kan uppnås bör man överväga att modifiera de ovannämnda parametrarna (t.ex. spränglängd, intensitet, arbetscykel, etc.).

Även om detta arbete visade en ökning av avfyrningshastigheten efter FUS-stimulering, måste mer data samlas in för att visa repeterbarheten av detta fynd innan några slutsatser dras. Detta protokoll ärver begränsningarna hos MEA-system, som vanligtvis har svagheter som härrör från den direkta mikroelektrodströmsignalen. Även om direktkontakt med neuronen ger bättre känslighet, kan det förändra cellen och påverka mätnoggrannheten. Dessutom, på grund av brunnarnas lilla storlek, inkluderar vårt system inte perifer vävnad, vilket också kan spela en roll i neuromodulering¹⁷. Detta kan begränsa tillämpligheten av de slutsatser som dras från denna konfiguration till in vivo-miljöer . För att studera mer komplexa nätverkssvar måste ett MEA-system med högre kanaltäthet utformas för att förbättra dess känslighet¹⁸. Flera framtida riktningar för detta föreslagna system har identifierats, inklusive användning av en 3D-portal för att hålla givaren och säkerställa korrekt placering¹⁹. Ytterligare förbättringar kan göras när det gäller efterbehandlingsalgoritmen, inklusive att använda en spikande sorteringsalgoritm²⁰ för att klassificera enskilda neuroner. Denna process skulle vara fördelaktig för att reda ut svaren från neuroner med flera enheter i framtida studier av mekanismerna för FUS. Viktigast av allt är att det är viktigt att införliva ytterligare stimuleringsmetoder, såsom kemiska, elektriska och optiska stimuli, för att belysa de underliggande mekanismerna. Dessa metoder kan förändra neuronala egenskaper och beteenden, till exempel genom att hämma specifika jonkanaler¹⁵ eller modifiera membranegenskaperna²¹. Genom att modulera huvudfaktorerna inom den hypotetiska signalvägen kan forskare identifiera bidragen från varje faktor i kontrollerade miljöer och i slutändan kasta ljus över de komplexa interaktioner som spelar in.

Elektrisk stimulering²² är en av de mest etablerade teknikerna för neuromodulering, med en lång historia av framgångsrika tillämpningar i kliniska och forskningsmiljöer. FUS och optogenetik²³ är däremot relativt nya modaliteter som har fått uppmärksamhet de senaste åren. De stora fördelarna med FUS är dess icke-invasivitet och förmåga att stimulera nervceller på djup som kan vara svåra att nå med andra tekniker, inklusive elektrisk stimulering och optogenetik. Liksom optogenetik²⁴ har FUS dock vissa begränsningar relaterade till modellering av vågutbredningen och associerade neuronala svar. Att fånga komplexiteten i vävnadens heterogena akustiska egenskaper in vivo kan vara utmanande, vilket leder till osäkerheter i tryckfältet och därmed i de neuronala svaren. Denna svårighet att exakt modellera dessa egenskaper utgör en utmaning när man optimerar tekniken för specifika verkliga applikationer. Den inneboende komplexiteten understryker vikten av in vitro-system som det i denna studie, eftersom de möjliggör direkta studier av respons under kontrollerade akustiska intensitetsförhållanden.

Sammanfattningsvis ger detta system en högkapacitets, in vitro-plattform för att studera de neuromodulerande effekterna av FUS på humana neuroner. Med detta system kan verkningsmekanismerna för FUS undersökas genom att mäta de elektriska svaren från mänskliga nervceller när de utsätts för olika nivåer och typer av stimulering i en kontrollerad miljö. Därför erbjuder den ett värdefullt kompletterande verktyg till de människo- och djurmodeller som vanligtvis används inom området.

Materials

MEA System	Axion Biosystem Inc.	Maestro Edge	Sampling Rate: 11500 Hz
MEA Plate	Axion Biosystem Inc.	CytoView MEA	Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells
Well plate Interface	Amcor Inc.	Parafilm PM996; P7793	Thickness: 127 µm
CO2 Tank and Regulator for culture	AirGas Inc./ Harris Inc.	9296NC	Concentration: 5%
Culture Media	ThermoFisher Inc.	Laminin; 23017-015	Concentration: 1 µg/mL
HiPSC Neurons	Peprotech	CIPS and GM01582 Derived; 450-10	Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13)
Transducer	Sonic Concepts Inc.	CTX250; 008	Center Frequency: 250 kHz
Matching Network	Sonic Concepts Inc.	CTX250; NFS102v2	Impedance: 50 Ω
Transducer Power Output (TPO)	Sonic Concepts Inc.	Version 4.1; 020	Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz
Membrane	McMaster Inc.	Silicone Rubber; 5542N115	Thickness: 0.0127 cm
Coupling Gel	Parker Laboratory Inc.	Aquasonic 100; B08DDWG GXB	Viscosity: 130,000–185,000 cops
Connection to Probe holder	McMaster Inc.	Steal Threaded Rod; 90322A661	Length: 1–1/2" Long
Centrifuge	ThermoFisher Inc.	Sorvall Legend X1R; 75004261	Max acceleration: 10–25,830 x g
Hydrophone	Sonic Concepts Inc.	Y-104; 009	Range: 50 kHz–1.9 MHz
Water Tank	Sonic Concepts Inc.	WT	Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm
Water Conditioning Unit	Sonic Concepts Inc.	WCU; SN006	Flow Velocity: 50 mL/s maximum
Oscilloscope	Rohde-Schwarz Inc.	RTC1002	Sampling rate: Up to 50 MHz
Stage	Sonic Concepts Inc.	MicroStage; 2	Accuracy: 1 µm
Thermochromic sheet	TIPTEMP Inc.	Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337	Range: 22–24 °C
Computer	Microsoft Surface	Surface Pro	CPU i5 1035G4: 3.7 GHz
Data Transfer Software	Mathworks Inc.	MATLAB	Version 2021b
Processing Software	Python Software Foundation	Python	Version 3.7.10