تقدم هذه الورقة طريقة قابلة للتكرار مع نتائج جديدة حول وجود الخلايا الظهارية في دم الإنسان والفأر الطبيعي ونخاع العظام باستخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري المناعي. تم استخدام الفئران المعدلة وراثيا Krt1-14 ؛ mTmG كطريقة في الجسم الحي لتأكيد هذه النتائج.
تم تحديد الخلايا الظهارية في الدم ونخاع العظام لمرضى السرطان وأمراض أخرى. ومع ذلك ، فإن وجود الخلايا الظهارية الطبيعية في الدم ونخاع العظام للأفراد الأصحاء لم يتم تحديده بعد بطريقة متسقة. تظهر هنا طريقة قابلة للتكرار لعزل الخلايا الظهارية من الدم البشري السليم والفئران ونخاع العظام (BM) باستخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري المناعي (IF). تم تحديد الخلايا الظهارية في الأفراد الأصحاء لأول مرة وعزلها عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام جزيء التصاق الخلايا الظهارية (EpCAM). تم تأكيد أن خلايا EpCAM + هذه تعبر عن الكيراتين باستخدام الفحص المجهري المناعي في الفئران المعدلة وراثيا Krt1-14 ؛ mTmG. كانت عينات الدم البشرية تحتوي على 0.18٪ ± 0.0004 خلية EpCAM + (SEM ؛ n = 7 مكررات بيولوجية ، 4 نسخ تجريبية مكررة). في BM البشري ، كان 3.53٪ ± 0.006 (SEM ؛ n = 3 نسخ بيولوجية ، 4 نسخ تجريبية مكررة) من الخلايا أحادية النواة EpCAM +. في دم الفأر ، شكلت خلايا EpCAM + 0.45٪ ± 0.0006 (SEM ؛ n = 2 مكررات بيولوجية ، 4 تكرارات تجريبية) ، وفي الفئران BM ، 5.17٪ ± 0.001 (SEM ؛ n = 3 مكررات بيولوجية ، 4 نسخ مكررة تجريبية) كانت EpCAM +. في الفئران ، كانت جميع خلايا EpCAM + مناعية لعموم السيتوكيراتين ، على النحو الذي يحدده الفحص المجهري IF. تم تأكيد النتائج باستخدام الفئران المعدلة وراثيا Krt1-14 ؛ mTmG ، مع انخفاض (8.6 خلايا GFP + أصلية لكل 106 خلايا تم تحليلها ؛ 0.085٪ من الخلايا القابلة للحياة) ، ولكن أعداد كبيرة (p < 0.0005) من خلايا GFP + الموجودة في الفئران الطبيعية BM ، والتي لم تكن نتيجة للعشوائية مقارنة مع الضوابط السلبية المتعددة. علاوة على ذلك ، كانت خلايا EpCAM + في دم الفئران أكثر تجانسا من خلايا CD45 + (0.58٪ في BM ؛ 0.13٪ في الدم). خلصت هذه الملاحظات إلى أن الخلايا التي تعبر عن بروتينات السيتوكيراتين قابلة للتكرار بين الخلايا أحادية النواة من دم الإنسان والفئران و BM. نوضح طريقة لحصاد الأنسجة ، وقياس التدفق الخلوي ، والتلوين المناعي التي يمكن استخدامها لتحديد وتحديد وظيفة هذه الخلايا الظهارية للسيتوكيراتين في الأفراد الأصحاء.
توجد الخلايا الظهارية في الحواجز المادية بين أجسامنا والبيئة وهي قادرة على التعرف على التغيرات في بيئتها المكروية والاستجابة لها1. لديهم مكانة الخلايا الجذعية المتكاثرة التي توفر وسيلة لتسليم الأنسجة الجديدة وإصلاح الضرر2. يدرس مختبرنا الخلايا الجذعية في بصيلات الشعر في الجلد. الجلد هو نموذج جيد لدراسة الأنسجة الظهارية وتكاثر الخلايا الجذعية لأنه يمكن رؤيته بسهولة وهناك دوران مستمر للخلايا. السرطانات الظهارية هي أكثر أشكال السرطان شيوعا ، ربما بسبب الأنسجة الظهارية ، مثل الجلد ، كونها خط الدفاع الأول ضد المواد المسرطنة البيئية ، مما يؤدي إلى ارتفاع معدلات الدوران وتكاثر الخلايا الظهارية3. تتكون معظم البشرة الجلدية ، الطبقة الواقية العليا ، من الخلايا الكيراتينية ، والتي تعبر عن أنواع مختلفة من الكيراتين لتوفير الدعم والبنية4. المرضى الذين يعانون من السرطانات الظهارية غالبا ما يكون لديهم خلايا ظهارية موجودة في دمائهم ونخاع العظام التي تعبر أيضا عن الكيراتين. الخزعات السائلة هي طريقة غير جراحية لاكتشاف ومراقبة هذه الخلايا الظهارية في سوائل الجسم المختلفة5. توجد الخلايا الظهارية المنتشرة ، والتي تسمى أيضا الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) ، في الدم المحيطي ويمكن أن تكون مؤشرات حيوية لتشخيص السرطان ، بالإضافة إلى توجيه علاجات العلاج الفردية. يمكن أن تشير CTCs أيضا إلى تطور المرض وفعالية العلاج وبقاء المريض بشكل عام 5,6.
جزيء التصاق الخلايا الظهارية (EpCAM) هو علامة مستخدمة سريريا ل CTCs ويمكنه تحديد الأورام ذات الأصل الظهاري في مرضى السرطان. يلعب EpCAM دورا في التصاق الخلايا ، والترحيل ، والإشارات ، والانتشار ، والتمايز6. لكي تصنف الخلية الظهارية المنتشرة على أنها CTC ، يجب أن تكون موجبة للسيتوكيراتين 8 و 18 و 19 ، وسالبة ل CD45 ، وهي علامة كريات الدم البيضاء الشائعة6. عادة ما يتم تحديد CTCs عن طريق استنفاد CD45 أولا مع الميكروبيدات المغناطيسية ، يليه اختبار EpCAM والسيتوكيراتين 19 باستخدام المجهر المناعي7. القيد الرئيسي في الكشف عن CTCs هو ندرتها. وهي تشكل أقل من 0.01٪ من جميع الخلايا في الدم ، وقليل جدا منها يعيش في الدورة الدموية للوصول إلى الأعضاء البعيدة8،9،10. يجب مراعاة تصميم التجارب والتقنيات لعزل وتحديد هذه الخلايا بسبب طبيعتها النادرة. حاليا ، لا يوجد سوى فارز آلي أحادي الخلية معتمد من إدارة الغذاء والدواء (FDA) يستخدم لتحديد CTCs ، ويستخدم EpCAM كعلامة حيوية له. تشمل الطرق الأخرى فصل الخرزة المغناطيسية وقياس التدفق الخلوي ، أو مزيج من هذه الطرق. هناك حاجة إلى تقنيات جديدة ذات حساسية وخصوصية أعلى للكشف عنCTCs 11 النادرة.
قياس التدفق الخلوي هو طريقة مفضلة للكشف عن مجموعات الخلايا النادرة في الدم ونخاع العظام وعينات الأنسجة الأخرى. يمكن أن تشمل هذه الخلايا النادرة الخلايا الجذعية والخلايا البطانية المنتشرة و CTCs وخلايا المرض المتبقية. يتيح قياس التدفق الخلوي إجراء قياسات كمية لكل نوع من الخلايا وفرز هذه الخلايا لإجراء مزيد من الاختبارات 7,9. تم إجراء تعداد تدريجي لضمان تقييم دقيق لهذه الخلايا النادرة. القدرة على استخدام البوابات لاستبعاد الخلايا من مزيد من التحليل هي وسيلة لزيادة الخصوصية عند تحليل الخلايا. قيود قياس التدفق الخلوي هي الوقت اللازم لتحليل العينات الكبيرة وعدم وجود تأكيد مرئي لهوية الخلية. للتغلب على هذا ، تم إجراء الفحص المجهري المناعي على الخلايا المصنفة لتأكيد هوياتها.
أظهر مختبرنا سابقا أنه في الفئران يتم تجنيد خلايا نخاع العظم وتساهم في أورام الجلد12. هذه الخلايا المشتقة من نخاع العظم إيجابية لعموم السيتوكيراتين وسيتوكيراتين البشرة. لمزيد من توضيح دور الخلايا الجذعية الظهارية والخلايا المشتقة من نخاع العظام والخلايا المعبرة عن السيتوكيراتين في تطور الورم ، تم البحث عن الخلايا الإيجابية للسيتوكيراتين EpCAM + في الفئران الطبيعية والدم البشري وعينات نخاع العظام. كما هو الحال مع معظم التجارب ، تم تطوير هذه الطريقة من خلال تكرارات متعددة. في السابق ، تم استخدام الفئران المعدلة وراثيا جنبا إلى جنب مع الأعداد الإضافية للبحث عن الخلايا المعبرة عن K14GFP في نخاع العظم12. مع عد المزيد من الخلايا، أمكن تحديد مجموعة تمثيلية من الخلايا النادرة، كما هو موضح في الشكل 1 في قسم النتائج التمثيلية. استند الأساس المنطقي للتحقيق في الخلايا الظهارية في الدم الطبيعي ونخاع العظام إلى الأدبيات المبكرة حول CTCs ، حيث كان لدى المتبرعين الأصحاء العاديين مستويات خلفية من خلايا EpCAM+ 13. كما ذكرنا سابقا ، غالبا ما يبدأ توصيف EpCAM باستنفاد CD45. تم حذف هذه الخطوة لأن بعض الخلايا المكونة للدم لها تعبير EpCAM و cytokeratin لأسباب غير معروفة تحتاج إلى مزيد من التحقيق. لذلك ، تم فرز الخلايا بناء على وجود أو عدم وجود EpCAM ، بغض النظر عن نسب الخلية ، ثم تم تطوينها المناعية للسيتوكيراتين. يصف البروتوكول الآتي وسير العمل الموضح في الشكل 2 تقنية تستخدم قياس التدفق الخلوي مع التعويض والضوابط، والطرق الإحصائية، والتصوير المناعي لعزل هذه المجموعات النادرة من الخلايا الطلائية وتحديدها.
هناك بعض الأدلة في الأدبيات على وجود الخلايا الظهارية في نخاع العظام. في السابق ، كانت الأوراق تبحث عادة في دور الخلايا الظهارية في سياق المرض والإصابة ، كما هو الحال في الكبد والرئة والجهاز الهضمي (GI) والغدة الصعترية والجلد14،15،16،17. ومع ذلك ، لا يعرف الكثير عن وجود هذه الخلايا الظهارية في نخاع العظام للأفراد الأصحاء. تسعى هذه الورقة إلى إنشاء طريقة قابلة للتكرار ، بهدف تحديد وعزل الخلايا الظهارية من الدم الطبيعي ونخاع العظام. ستدفع هذه الطريقة المجال إلى الأمام لتحديد سبب وجود الخلايا الظهارية وما هو دورها في الدم ونخاع العظام في غياب المرض. ربما تكون هذه الخلايا جزءا من صيانة الأنسجة الطبيعية أو يتم تنشيطها في أوقات الإصابة. نخاع العظم هو مستودع للخلايا الجذعية. ومع ذلك ، فمن غير الواضح ما هو نسب هذه الخلايا الظهارية. تناقش ورقة بحثية حديثة الخلايا الظهارية المشتقة من نخاع العظم في الغدة الصعترية ، والتي تعبر أولا عن EpCAM وعلامة المكونة للدم CD45 ، ثم تفقد تعبير CD45 بمرور الوقت بعد الإصابة15. أكدت الأبحاث من مختبرنا أيضا وجود خلايا CD45 + EpCAM + داخل الدم السليم ونخاع العظام في حالة عدم وجود إصابة12. ومع ذلك ، فإن دور هذه الخلايا لم يتحدد بعد.
كانت هناك حاجة إلى طريقة قابلة للتكرار لفحص الخلايا الظهارية داخل نخاع العظم السليم. ستساعد الطريقة الموضحة في توصيف هذه الخلايا بشكل أكبر في حالتها الطبيعية. هناك خطوات مهمة في هذه الطريقة للحفاظ على التكاثر. واحدة من أهم الخطوات في هذا البروتوكول هي الحفاظ على بيئة معقمة في غطاء المحرك أثناء حصاد نخاع العظم من الفئران. في حالة الحصاد من فئران متعددة ، يتم تجنب التلوث المتبادل بين العينات باستخدام إبر ومحاقن جديدة لكل فأر. هذا يضمن أيضا أن العينة نظيفة وخالية من أي ملوثات قد تؤثر على النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، يجب زيادة عدد المحاقن المعدة والأنابيب المخروطية الموسومة لكل ماوس إضافي. خطوة أخرى مهمة تنطوي على غسل العظام حتى يصبح اللون الأبيض النظيف واضحا لضمان إزالة معظم خلايا نخاع العظم. تزداد فرص اكتشاف الخلايا النادرة في عينة أنقى. تم إجراء تعديل لتحسين بروتوكول تحلل خلايا الدم الحمراء. تم اختبار العديد من مخازن التحلل للعثور على المخزن الصحيح الذي أعطى قابلية عالية باستمرار ، حيث تم فقد ما يقرب من نصف الخلايا خلال هذه الخطوة. قد تحتاج الكواشف المختلفة وفترات الحضانة إلى تحسين النتائج في بيئات أخرى.
أهم قيود هذا البروتوكول هو استخدام قياس التدفق الخلوي للعثور على مجموعات الخلايا النادرة. كما نوقش سابقا ، تساعد إضافة عناصر التحكم والأعداد الإضافية على زيادة خصوصية التحليل ودقته. ومن القيود الأخرى أنه يجب تحديد العلامات المناسبة للسكان موضع الاهتمام مسبقا. وبالتالي ، يحتاج المرء إلى معرفة العلامات الرئيسية والأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي والأجسام المضادة المتوافقة مع الأنواع المستهدفة.
هذه الطرق هي تحسين على الطرق الحالية لأنها تسمح بتحليل خلية واحدة بجزء بسيط من تكلفة عازل CTC التلقائي الحالي وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يتوفر قياس التدفق الخلوي بسهولة أكبر. حافظت FACS على صلاحية أعلى للخلايا مقارنة بالنتائج المبلغ عنها سابقا باستخدام فصل الميكروبيدات المغناطيسية. أخيرا ، تسمح هذه التقنيات بفصل الخلايا لتحليلات المصب ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي السائب أو تسلسل scRNA أو زراعة الخلايا.
The authors have nothing to disclose.
جوش مونتس ، فني مقياس تدفق الخلايا في المرفق الأساسي ، معهد هورميل
تود شوستر، مدير المرافق الأساسية، معهد هورميل
ديريك جوردون ، إحصائي ، جامعة روتجرز
نود أن نشكر كارين كلاين من كلاروس للخدمات التحريرية ، سانتا في ، نيو مكسيكو على مساعدتها التحريرية.
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض الجهاز العضلي الهيكلي والجلد التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب رقم الجائزة R21 AR075281 ، ومنحة مساعدة البحث والفن والمنح الدراسية ، مكتب نائب الرئيس للأبحاث ، جامعة مينيسوتا (اقتراح #324240). نحن نقدر بامتنان الدعم المقدم من معهد هورمل.
40 μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Used to filter out any large clumps of cells from bone marrow |
5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes used for flow cytometry |
500 mL jar with lid | Nalgene | 11-823-32 | Used to wash the mouse |
190 proof Ethanol | Decon laboratories Inc | 2801 | Diluted to 70% with dH2O |
Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | Dilution: 1:1000 |
Brightline Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-10 | Used to count alive cells |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | Component of antibody diluent |
Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Component of staining buffer and harvesting solution |
Curity gauze sponges | Covidien | 2187 | Used to keep a clean work area when harvesting limbs and bone marrow |
Curved Forceps | Miltex | 18-784 | Used during harvest |
Cytokeratin, Wide Spectrum Screening | Dako | Z0622 | Dilution 1:750 *Now discontinued |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS 1x) | Gibco | 14190-144 500mL | Used to stop the red blood cell lysis reaction |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E9884-100G | Used at 0.5 M |
Gentamicin sulfate | Lonza | 17-518Z | Component of harvesting solution |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS 1x) | Gibco | 14175-095 500mL | Component of harvesting solution and staining buffer solution |
Luer-Lok tip 10 mL syringe | Becton, Dickinson and Co | 309604 | Used with 26G needle to flush bones, used with 20G needle to break up clumps |
Magic touch 2 ice bucket | BelArt | M16807-2001 | Used to store the specimens on ice |
Nonfat dry milk | Apex | 20-241 | Component of Antibody Diluent |
Normal horse serum | Vector | ZE0122 | Component of Antibody Diluent |
PE anti-human CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 324206 | Dilution: 5 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE anti-mouse CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 118205 | Dilution: 3 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE mouse IgG2b, κ isotype control | Biolegend | 400313 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE rat anti-human CD49f | BD Biosciences | 555763 | Dilution: 20 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE rat IgG2am, κ Isotype control | Biolegend | 400508 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1×106 cells |
Polypropylene Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Basix | 14-955-240 | Used in the centrifuge |
Povidone-Iodine Scrub | Aplicare | 82-227 | Antiseptic used to sterilize the mice |
PrecisionGlide Needle 20G x 1 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305176 | 20G needle used to break up bone marrow clumps |
PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305111 | 26G needle used to flush bone marrow from bones |
PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Services | 63422-06 | 8 well slides cells sorted onto for immunofluorescence |
RBC Lysis buffer 10X | Invitrogen | 00-4300-54 | Dilution 1:10 using sterile deionized water |
Scissors | Roboz | RS-6762 | Used during harvest |
Stainless steel surgical blade #4 | Bard-Parker | 371222 | Used during harvest |
Sterile tray | Polar ware | 10F | Used during harvest |
StretchEase Powder-free nitrile examination gloves | Denville Scientific | G4161 | Used during harvest |
Surgical Scalpel handle #4 | Fischer | 12-000-164 | Used with surgical blade |
TBS 20x | Thermo | Component of TBST, used at 1X | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Used to count dead cells. Filtered with .45 µm |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-500mL | Component of TBST |
Tweezers | Miltex | 6-8 | Used during harvest |
Vectashield Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1800 | Nuclear stain for immunofluorescence |