Dette papir præsenterer en reproducerbar metode med nye fund om tilstedeværelsen af epitelceller i normalt humant og museblod og knoglemarv ved hjælp af flowcytometri og immunofluorescensmikroskopi. Krt1-14;mTmG transgene mus blev brugt som en in vivo metode til at bekræfte disse fund.
Epitelceller er blevet identificeret i blod og knoglemarv hos patienter med kræft og andre sygdomme. Imidlertid er tilstedeværelsen af normale epitelceller i blod og knoglemarv hos raske individer endnu ikke identificeret på en konsekvent måde. Her præsenteres en reproducerbar metode til isolering af epitelceller fra sundt humant og murin blod og knoglemarv (BM) ved hjælp af flowcytometri og immunofluorescens (IF) mikroskopi. Epitelceller hos raske individer blev først identificeret og isoleret via flowcytometri ved hjælp af epitelcelleadhæsionsmolekyle (EpCAM). Disse EpCAM+ celler blev bekræftet at udtrykke keratin ved hjælp af immunofluorescensmikroskopi i Krt1-14;mTmG transgene mus. Humane blodprøver havde 0,18% ± 0,0004 EpCAM+ celler (SEM; n = 7 biologiske replikater, 4 eksperimentelle replikater). I human BM var 3,53% ± 0,006 (SEM; n = 3 biologiske replikater, 4 eksperimentelle replikater) af mononukleære celler EpCAM+. I museblod udgjorde EpCAM+ celler 0,45% ± 0,0006 (SEM; n=2 biologiske replikater, 4 eksperimentelle replikater), og i mus BM var 5,17% ± 0,001 (SEM; n=3 biologiske replikater, 4 eksperimentelle replikater) EpCAM+. Hos mus var alle EpCAM+ cellerne immunreaktive over for pan-cytokeratin, bestemt ved IF-mikroskopi. Resultaterne blev bekræftet ved hjælp af Krt1-14;mTmG transgene mus med lave (8,6 native GFP+ celler pr. 106 analyserede celler; 0,085% af levedygtige celler), men et signifikant antal (p < 0,0005) GFP+ celler til stede i normal murine BM, der ikke var resultatet af tilfældighed sammenlignet med flere negative kontroller. Desuden var EpCAM+ celler i museblod mere heterogene end CD45+ celler (0,58% i BM; 0,13% i blod). Disse observationer konkluderer, at celler, der udtrykker cytokeratinproteiner, kan påvises reproducerbart blandt mononukleære celler fra humant og murinblod og BM. Vi demonstrerer en metode til vævshøstning, flowcytometri og immunfarvning, der kan bruges til at identificere og bestemme funktionen af disse pan-cytokeratinepitelceller hos raske individer.
Epitelceller findes i de fysiske barrierer mellem vores kroppe og miljøet og er i stand til at genkende og reagere på ændringer i deres mikromiljø1. De har en voksende stamcelleniche, som giver en måde at vende nyt væv og reparere skader2. Vores laboratorium studerer stamceller i hudens hårsække; Hud er en god model til at studere epitelvæv og stamcellespredning, fordi det er let synligt, og der er en konstant omsætning af celler. Epitelkræft er den mest almindelige form for kræft, muligvis på grund af epitelvæv, såsom huden, der er den første forsvarslinje mod kræftfremkaldende stoffer i miljøet, hvilket fører til høje omsætningshastigheder og spredning af epitelceller3. Det meste af hudens epidermis, det øverste beskyttende lag, består af keratinocytter, som udtrykker forskellige typer keratiner for at give støtte og struktur4. Patienter med epitelkræft har ofte epitelceller til stede i deres blod og knoglemarv, der også udtrykker keratiner. Flydende biopsier er en ikke-invasiv måde at detektere og overvåge disse epitelceller i forskellige kropsvæsker5. Cirkulerende epitelceller, også kaldet cirkulerende tumorceller (CTC’er), findes i perifert blod og kan være biomarkører for kræftprognose samt guide individualiserede terapibehandlinger. CTC’er kan også indikere sygdomsprogression, behandlingseffektivitet og samlet patientoverlevelse 5,6.
Epitelcelleadhæsionsmolekyle (EpCAM) er en klinisk anvendt markør for CTC’er og kan identificere tumorer af epiteloprindelse hos kræftpatienter. EpCAM spiller en rolle i celleadhæsion, migration, signalering, spredning og differentiering6. For at en cirkulerende epitelcelle skal klassificeres som en CTC, skal den være positiv for cytokeratiner 8, 18 og 19 og negativ for CD45, en almindelig leukocytmarkør6. CTC’er identificeres normalt ved først at nedbryde CD45 med magnetiske mikroperler efterfulgt af test for EpCAM og cytokeratin 19 ved anvendelse af immunofluorescensmikroskopi7. Den største begrænsning i påvisning af CTC’er er deres sjældenhed; De udgør mindre end 0,01% af alle celler i blodet, og meget få overlever i omløb for at nå fjerne organer 8,9,10. Der skal tages hensyn til design af eksperimenter og teknikker til isolering og identifikation af disse celler på grund af deres sjældne natur. I øjeblikket er der kun en Food and Drug Administration (FDA) -godkendt automatiseret enkeltcellesorterer, der bruges til at identificere CTC’er, og den bruger EpCAM som biomarkør. Andre metoder omfatter magnetisk perleseparation og flowcytometri eller en kombination af disse metoder. Der er behov for nye teknikker, der har større følsomhed og specificitet til påvisning af sjældne CTC’er11.
Flowcytometri er en foretrukken metode til påvisning af sjældne cellepopulationer i blod, knoglemarv og andre vævsprøver. Disse sjældne celler kan omfatte stamceller, cirkulerende endotelceller, CTC’er og resterende sygdomsceller. Flowcytometri muliggør kvantitative målinger af hver celletype og sorterer disse celler til yderligere test 7,9. Der blev udført trinvise tællinger for at sikre en nøjagtig vurdering af disse sjældne celler. Evnen til at bruge gating til at udelukke celler fra yderligere analyse er en måde at øge specificiteten på, når man analyserer celler. Begrænsningerne ved flowcytometri er den tid, der kræves til analyse af store prøver og manglen på visuel bekræftelse for celleidentitet. For at overvinde dette blev immunofluorescensmikroskopi udført på de sorterede celler for at bekræfte deres identiteter.
Tidligere har vores laboratorium vist, at knoglemarvscellerne rekrutteres hos mus og bidrager til hudtumorer12. Disse knoglemarvsafledte celler er positive for pan-cytokeratin og epidermal cytokeratin. For yderligere at belyse rollen af epitelstamceller, knoglemarvsafledte celler og cytokeratinekspressive celler i tumorprogression blev EpCAM+ cytokeratinpositive celler i normale murin og humane blod- og knoglemarvsprøver ledt efter. Som med de fleste eksperimenter blev denne metode udviklet gennem flere iterationer. Tidligere blev transgene mus brugt sammen med inkrementelle tællinger til at lede efter K14GFP-ekspressive celler i knoglemarven12. Efterhånden som flere celler blev talt, kunne en repræsentativ population af sjældne celler identificeres, som vist i figur 1 i afsnittet om repræsentative resultater. Begrundelsen for at undersøge epitelceller i normalt blod og knoglemarv var baseret på tidlig litteratur om CTC’er, hvor normale raske donorer havde baggrundsniveauer af EpCAM+ celler13. Som tidligere nævnt begynder EpCAM-karakterisering ofte med udtømningen af CD45. Dette trin blev udeladt, fordi nogle hæmatopoietiske celler har EpCAM og cytokeratinekspression af ukendte årsager, der skal undersøges yderligere. Derfor blev celler sorteret baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af EpCAM, uanset celleafstamning, og derefter immunfarvet for cytokeratin. Protokollen nedenfor og arbejdsgangen vist i figur 2 beskriver en teknik, der bruger flowcytometri med kompensation og kontrol, statistiske metoder og immunfluorescensbilleddannelse til at isolere og identificere disse sjældne populationer af epitelceller.
Der er nogle beviser i litteraturen for tilstedeværelsen af epitelceller i knoglemarven. Tidligere har papirer typisk undersøgt epitelcellernes rolle i forbindelse med sygdom og skade, såsom i leveren, lungen, mave-tarmkanalen (GI), thymus og hud14,15,16,17. Imidlertid er der ikke meget kendt om tilstedeværelsen af disse epitelceller i knoglemarven hos raske individer. Dette papir søger at etablere en reproducerbar metode med det formål at identificere og isolere epitelceller fra normalt blod og knoglemarv. Denne metode vil drive feltet fremad for at identificere, hvorfor epitelceller er til stede, og hvad deres rolle er i blodet og knoglemarven i fravær af sygdom; Måske er disse celler en del af normal vævsvedligeholdelse eller aktiveres i tider med skade. Knoglemarven er et lager af stamceller; Det er imidlertid uklart, hvad afstamningen af disse epitelceller kan være. Et nyligt papir diskuterer knoglemarvsafledte epitelceller i thymus, der først udtrykker EpCAM og den hæmatopoietiske markør CD45 og derefter mister sit CD45-udtryk over tid efter skade15. Forskning fra vores laboratorium har også bekræftet tilstedeværelsen af CD45+ EpCAM+ celler i sundt blod og knoglemarv i fravær af skade12. Imidlertid er disse cellers rolle endnu ikke bestemt.
Der var behov for en reproducerbar metode til at undersøge epitelceller i den raske knoglemarv. Den beskrevne metode hjælper med at karakterisere disse celler yderligere i deres normale tilstand. Der er vigtige trin i denne metode for at opretholde reproducerbarhed. Et af de mest kritiske trin i denne protokol er at opretholde et sterilt miljø i emhætten, mens knoglemarven høstes fra mus. Ved udtagning fra flere mus undgås krydskontaminering mellem prøver ved brug af nye nåle og sprøjter til hver mus. Dette sikrer også, at prøven er ren og fri for forurenende stoffer, der kan påvirke resultaterne. Derudover bør antallet af forberedte sprøjter og mærkede koniske rør for hver ekstra mus øges. Et andet vigtigt skridt indebærer skylning af knoglerne, indtil en ren hvid farve er tydelig for at sikre, at de fleste knoglemarvsceller er fjernet; Chancerne for at detektere sjældne celler øges i en renere prøve. Der blev foretaget en ændring for at optimere protokollen for lyse af røde blodlegemer; Flere lysisbuffere blev testet for at finde den rigtige, der gav konsekvent høj levedygtighed, da næsten halvdelen af cellerne gik tabt under dette trin. Forskellige reagenser og inkubationsperioder skal muligvis optimeres for forbedrede resultater i andre indstillinger.
Den væsentligste begrænsning af denne protokol er at bruge flowcytometri til at finde sjældne cellepopulationer. Som tidligere nævnt hjælper tilføjelsen af kontroller og trinvise tællinger med at øge analysens specificitet og nøjagtighed. En anden begrænsning er, at passende markører for den relevante population skal identificeres på forhånd. Således skal man vide om nøglemarkører, antistoffer til flowcytometri og antistoffer, der er kompatible med målarterne.
Disse metoder er en forbedring i forhold til eksisterende metoder, da de giver mulighed for enkeltcelleanalyse til en brøkdel af omkostningerne ved den eksisterende automatiske CTC-isolator og enkeltcelle RNA-sekventering. Derudover er flowcytometri lettere tilgængelig. FACS opretholdt højere levedygtighed for cellerne sammenlignet med tidligere rapporterede resultater ved hjælp af magnetisk mikroperleseparation. Endelig muliggør disse teknikker adskillelse af celler til downstream-analyser, såsom bulk-RNA-sekventering, scRNA-sekventering eller cellekultur.
The authors have nothing to disclose.
Josh Monts, tekniker inden for flowcytometer til kernefaciliteter, Hormel Institute
Todd Schuster, Core Facility Manager, The Hormel Institute
Derek Gordon, statistiker, Rutgers University
Vi vil gerne takke Karen Klein fra Clarus Editorial Services, Santa Fe, NM for hendes redaktionelle assistance.
Dette arbejde blev delvist støttet af National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under tildelingsnummer R21 AR075281 og et tilskud til forskning, kunst og stipendium, vicepræsidentens kontor for forskning, University of Minnesota (forslag # 324240). Vi takker for støtten fra The Hormel Institute.
40 μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Used to filter out any large clumps of cells from bone marrow |
5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes used for flow cytometry |
500 mL jar with lid | Nalgene | 11-823-32 | Used to wash the mouse |
190 proof Ethanol | Decon laboratories Inc | 2801 | Diluted to 70% with dH2O |
Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | Dilution: 1:1000 |
Brightline Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-10 | Used to count alive cells |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | Component of antibody diluent |
Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Component of staining buffer and harvesting solution |
Curity gauze sponges | Covidien | 2187 | Used to keep a clean work area when harvesting limbs and bone marrow |
Curved Forceps | Miltex | 18-784 | Used during harvest |
Cytokeratin, Wide Spectrum Screening | Dako | Z0622 | Dilution 1:750 *Now discontinued |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS 1x) | Gibco | 14190-144 500mL | Used to stop the red blood cell lysis reaction |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E9884-100G | Used at 0.5 M |
Gentamicin sulfate | Lonza | 17-518Z | Component of harvesting solution |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS 1x) | Gibco | 14175-095 500mL | Component of harvesting solution and staining buffer solution |
Luer-Lok tip 10 mL syringe | Becton, Dickinson and Co | 309604 | Used with 26G needle to flush bones, used with 20G needle to break up clumps |
Magic touch 2 ice bucket | BelArt | M16807-2001 | Used to store the specimens on ice |
Nonfat dry milk | Apex | 20-241 | Component of Antibody Diluent |
Normal horse serum | Vector | ZE0122 | Component of Antibody Diluent |
PE anti-human CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 324206 | Dilution: 5 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE anti-mouse CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 118205 | Dilution: 3 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE mouse IgG2b, κ isotype control | Biolegend | 400313 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE rat anti-human CD49f | BD Biosciences | 555763 | Dilution: 20 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE rat IgG2am, κ Isotype control | Biolegend | 400508 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1×106 cells |
Polypropylene Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Basix | 14-955-240 | Used in the centrifuge |
Povidone-Iodine Scrub | Aplicare | 82-227 | Antiseptic used to sterilize the mice |
PrecisionGlide Needle 20G x 1 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305176 | 20G needle used to break up bone marrow clumps |
PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305111 | 26G needle used to flush bone marrow from bones |
PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Services | 63422-06 | 8 well slides cells sorted onto for immunofluorescence |
RBC Lysis buffer 10X | Invitrogen | 00-4300-54 | Dilution 1:10 using sterile deionized water |
Scissors | Roboz | RS-6762 | Used during harvest |
Stainless steel surgical blade #4 | Bard-Parker | 371222 | Used during harvest |
Sterile tray | Polar ware | 10F | Used during harvest |
StretchEase Powder-free nitrile examination gloves | Denville Scientific | G4161 | Used during harvest |
Surgical Scalpel handle #4 | Fischer | 12-000-164 | Used with surgical blade |
TBS 20x | Thermo | Component of TBST, used at 1X | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Used to count dead cells. Filtered with .45 µm |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-500mL | Component of TBST |
Tweezers | Miltex | 6-8 | Used during harvest |
Vectashield Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1800 | Nuclear stain for immunofluorescence |