Denne artikkelen presenterer en reproduserbar metode med nye funn om tilstedeværelse av epitelceller i normalt humant og musblod og benmarg ved bruk av flowcytometri og immunfluorescensmikroskopi. Krt1-14;mTmG transgene mus ble brukt som en in vivo metode for å bekrefte disse funnene.
Epitelceller har blitt identifisert i blod og benmarg hos pasienter med kreft og andre sykdommer. Imidlertid har tilstedeværelsen av normale epitelceller i blod og benmarg hos friske individer ennå ikke blitt identifisert på en konsistent måte. Her presenteres en reproduserbar metode for isolering av epitelceller fra friskt humant og murine blod og benmarg (BM) ved bruk av flowcytometri og immunfluorescens (IF) mikroskopi. Epitelceller hos friske individer ble først identifisert og isolert via flowcytometri ved hjelp av epitelcelleadhesjonsmolekyl (EpCAM). Disse EpCAM+-cellene ble bekreftet å uttrykke keratin ved hjelp av immunfluorescensmikroskopi i Krt1-14;mTmG transgene mus. Humane blodprøver hadde 0,18 % ± 0,0004 EpCAM+-celler (SEM; n=7 biologiske replikater, 4 eksperimentelle replikater). I human BM var 3,53 % ± 0,006 (SEM; n=3 biologiske replikater, 4 eksperimentelle replikater) av mononukleære celler EpCAM+. I museblod utgjorde EpCAM+-celler 0,45 % ± 0,0006 (SEM; n=2 biologiske replikater, 4 eksperimentelle replikater), og i musens BM var 5,17 % ± 0,001 (SEM; n=3 biologiske replikater, 4 eksperimentelle replikater) EpCAM+. Hos mus var alle EpCAM+-cellene immunoreaktive mot pancytokeratin, som bestemt ved IF-mikroskopi. Resultatene ble bekreftet ved bruk av Krt1-14; mTmG transgene mus, med lave (8,6 opprinnelige GFP + celler per 106 celler analysert; 0,085% av levedyktige celler), men signifikante tall (p < 0,0005) av GFP + celler tilstede i normal murine BM, som ikke var et resultat av tilfeldighet sammenlignet med flere negative kontroller. Videre var EpCAM+-celler i museblod mer heterogene enn CD45+-celler (0,58 % i BM; 0,13 % i blod). Disse observasjonene konkluderer med at celler som uttrykker cytokeratinproteiner er reproduserbart detekterbare blant mononukleære celler fra humant og murine blod og BM. Vi demonstrerer en metode for vevshøsting, flowcytometri og immunfarging som kan brukes til å identifisere og bestemme funksjonen til disse pan-cytokeratinepitelcellene hos friske individer.
Epitelceller finnes i de fysiske barrierene mellom kroppen vår og miljøet og er i stand til å gjenkjenne og reagere på endringer i mikromiljøet1. De har en spredende stamcellenisje som gir en måte å snu nytt vev og reparere skader2. Vårt laboratorium studerer stamceller i hårsekkene i huden; Hud er en god modell for å studere epitelvev og stamcelleproliferasjon fordi det er lett synlig og det er en konstant omsetning av celler. Epitelkreft er den vanligste formen for kreft, muligens på grunn av epitelvev, som huden, som er den første forsvarslinjen mot miljøkreftfremkallende stoffer, noe som fører til høye omsetningshastigheter og spredning av epitelceller3. Det meste av hudepidermis, det øverste beskyttende laget, består av keratinocytter, som uttrykker forskjellige typer keratiner for å gi støtte og struktur4. Pasienter med epitelkreft har ofte epitelceller tilstede i blodet og benmargen som også uttrykker keratiner. Flytende biopsier er en ikke-invasiv måte å oppdage og overvåke disse epitelcellene i forskjellige kroppsvæsker5. Sirkulerende epitelceller, også kalt sirkulerende tumorceller (CTC), finnes i perifert blod og kan være biomarkører for kreftprognose, samt veilede individualiserte terapibehandlinger. CTC kan også indikere sykdomsprogresjon, behandlingseffekt og total pasientoverlevelse 5,6.
Epitelcelleadhesjonsmolekyl (EpCAM) er en klinisk brukt markør for CTC og kan identifisere svulster av epitelial opprinnelse hos kreftpasienter. EpCAM spiller en rolle i celleadhesjon, migrasjon, signalering, spredning og differensiering6. For at en sirkulerende epitelcelle skal klassifiseres som CTC, må den være positiv for cytokeratiner 8, 18 og 19, og negativ for CD45, en vanlig leukocyttmarkør6. CTC identifiseres vanligvis ved først å tømme CD45 med magnetiske mikroperler, etterfulgt av testing for EpCAM og cytokeratin 19 ved bruk av immunfluorescensmikroskopi7. Hovedbegrensningen i påvisning av CTC er deres sjeldenhet; De utgjør mindre enn 0,01% av alle celler i blodet, og svært få overlever i omløp for å nå fjerne organer 8,9,10. Det må tas hensyn til å designe eksperimenter og teknikker for å isolere og identifisere disse cellene på grunn av deres sjeldne natur. For tiden er det bare en Food and Drug Administration (FDA) godkjent automatisert enkeltcellesorterer som brukes til å identifisere CTC, og den bruker EpCAM som biomarkør. Andre metoder inkluderer magnetisk dråpeseparasjon og flowcytometri, eller en kombinasjon av disse metodene. Det er behov for nye teknikker som har høyere sensitivitet og spesifisitet for påvisning av sjeldne CTCer11.
Flowcytometri er en foretrukket metode for påvisning av sjeldne cellepopulasjoner i blod, benmarg og andre vevsprøver. Disse sjeldne cellene kan inkludere stamceller, sirkulerende endotelceller, CTC og gjenværende sykdomsceller. Flowcytometri muliggjør kvantitative målinger av hver celletype og sorterer disse cellene for videre testing 7,9. Inkrementelle tellinger ble utført for å sikre en nøyaktig vurdering av disse sjeldne cellene. Evnen til å bruke gating for å ekskludere celler fra videre analyse er en måte å øke spesifisiteten ved analyse av celler. Begrensningene ved flowcytometri er tiden som kreves for analyse av store prøver og mangelen på visuell bekreftelse for celleidentitet. For å overvinne dette ble immunfluorescensmikroskopi utført på de sorterte cellene for å bekrefte deres identiteter.
Tidligere har vårt laboratorium vist at hos mus rekrutteres benmargscellene og bidrar til hudsvulster12. Disse benmargsavledede cellene er positive for pan-cytokeratin og epidermal cytokeratin. For ytterligere å belyse rollen til epiteliale stamceller, benmargsavledede celler og cytokeratinuttrykkende celler i tumorprogresjon, ble EpCAM+ cytokeratin-positive celler i normale murine og humane blod- og benmargsprøver søkt etter. Som med de fleste eksperimenter ble denne metoden utviklet gjennom flere iterasjoner. Tidligere ble transgene mus brukt sammen med inkrementelle tellinger for å lete etter K14GFP-uttrykkende celler i beinmargen12. Etter hvert som flere celler ble talt, kunne en representativ populasjon av sjeldne celler identifiseres, som vist i figur 1 i den representative resultatdelen. Begrunnelsen for å undersøke epitelceller i normalt blod og benmarg var basert på tidlig litteratur om CTC, der normale friske donorer hadde bakgrunnsnivå av EpCAM+-celler13. Som nevnt tidligere begynner EpCAM-karakterisering ofte med uttømming av CD45. Dette trinnet ble utelatt fordi noen hematopoietiske celler har EpCAM og cytokeratinuttrykk av ukjente årsaker som må undersøkes nærmere. Derfor ble cellene sortert basert på tilstedeværelse eller fravær av EpCAM, uavhengig av cellelinje, og deretter immunfarget for cytokeratin. Protokollen nedenfor og arbeidsflyten vist i figur 2 beskriver en teknikk som bruker flowcytometri med kompensasjon og kontroller, statistiske metoder og immunfluorescensavbildning for å isolere og identifisere disse sjeldne populasjonene av epitelceller.
Det er noen bevis i litteraturen på tilstedeværelsen av epitelceller i benmargen. Tidligere har papirer typisk undersøkt epitelcellers rolle i sammenheng med sykdom og skade, for eksempel i leveren, lungen, mage-tarmkanalen (GI), thymus og hud14,15,16,17. Imidlertid er det ikke mye kjent om tilstedeværelsen av disse epitelcellene i beinmarg hos friske individer. Denne artikkelen søker å etablere en reproduserbar metode, med sikte på å identifisere og isolere epitelceller fra normalt blod og benmarg. Denne metoden vil drive feltet fremover for å identifisere hvorfor epitelceller er tilstede og hva deres rolle er i blod og benmarg i fravær av sykdom; Kanskje disse cellene er en del av normalt vev vedlikehold eller aktivert i tider med skade. Benmargen er et lager av stamceller; Det er imidlertid uklart hva avstamningen til disse epitelcellene kan være. En nylig artikkel diskuterer benmargsavledede epitelceller i thymus, som først uttrykker EpCAM og den hematopoietiske markøren CD45, og deretter mister CD45-uttrykket over tid etter skade15. Forskning fra laboratoriet vårt har også bekreftet tilstedeværelsen av CD45+ EpCAM+-celler i sunt blod og benmarg i fravær av skade12. Imidlertid er rollen til disse cellene ennå ikke bestemt.
Det var behov for en reproduserbar metode for å undersøke epitelceller i den friske benmargen. Den beskrevne metoden vil bidra til å karakterisere disse cellene videre i sin normale tilstand. Det er viktige trinn i denne metoden for å opprettholde reproduserbarhet. Et av de mest kritiske trinnene i denne protokollen er å opprettholde et sterilt miljø i hetten mens du høster benmargen fra mus. Ved høsting fra flere mus unngås krysskontaminering mellom prøvene ved å bruke nye nåler og sprøyter for hver mus. Dette sikrer også at prøven er ren og fri for forurensninger som kan påvirke resultatene. I tillegg bør antall forberedte sprøyter og merkede koniske rør for hver ekstra mus økes. Et annet viktig skritt innebærer å skylle beinene til en ren hvit farge er tydelig for å sikre at de fleste benmargcellene er fjernet; Sjansene for å oppdage sjeldne celler øker i en renere prøve. En modifikasjon ble gjort for å optimalisere lysisprotokollen for røde blodlegemer; Flere lysisbuffere ble testet for å finne den rette som ga konsekvent høy levedyktighet, da nesten halvparten av cellene gikk tapt i løpet av dette trinnet. Ulike reagenser og inkubasjonsperioder må kanskje optimaliseres for bedre resultater i andre innstillinger.
Den viktigste begrensningen i denne protokollen er å bruke flowcytometri for å finne sjeldne cellepopulasjoner. Som diskutert tidligere, bidrar tillegg av kontroller og inkrementelle tellinger til å øke spesifisiteten og nøyaktigheten av analysen. En annen begrensning er at hensiktsmessige markører for populasjonen av interesse må identifiseres på forhånd. Dermed må man vite om nøkkelmarkører, antistoffer for flowcytometri og antistoffer som er kompatible med målartene.
Disse metodene er en forbedring i forhold til eksisterende metoder, da de tillater enkeltcelleanalyse til en brøkdel av kostnaden for den eksisterende automatiske CTC-isolatoren og enkeltcelle RNA-sekvensering. I tillegg er flowcytometri lettere tilgjengelig. FACS opprettholdt høyere levedyktighet for cellene sammenlignet med tidligere rapporterte resultater ved bruk av magnetisk mikroperleseparasjon. Til slutt tillater disse teknikkene separasjon av celler for nedstrømsanalyser, for eksempel bulk RNA-sekvensering, scRNA-sekvensering eller cellekultur.
The authors have nothing to disclose.
Josh Monts, Core Facility Flow Cytometer tekniker, The Hormel Institute
Todd Schuster, leder for kjernefasiliteter, Hormel-instituttet
Derek Gordon, statistiker, Rutgers University
Vi takker Karen Klein fra Clarus Editorial Services, Santa Fe, NM for redaksjonell hjelp.
Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under tildelingsnummer R21 AR075281, og et stipend til hjelp for forskning, artisteri og stipend, kontoret til visepresidenten for forskning, University of Minnesota (forslag # 324240). Vi takker for støtten fra The Hormel Institute.
40 μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Used to filter out any large clumps of cells from bone marrow |
5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes used for flow cytometry |
500 mL jar with lid | Nalgene | 11-823-32 | Used to wash the mouse |
190 proof Ethanol | Decon laboratories Inc | 2801 | Diluted to 70% with dH2O |
Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | Dilution: 1:1000 |
Brightline Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-10 | Used to count alive cells |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | Component of antibody diluent |
Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Component of staining buffer and harvesting solution |
Curity gauze sponges | Covidien | 2187 | Used to keep a clean work area when harvesting limbs and bone marrow |
Curved Forceps | Miltex | 18-784 | Used during harvest |
Cytokeratin, Wide Spectrum Screening | Dako | Z0622 | Dilution 1:750 *Now discontinued |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS 1x) | Gibco | 14190-144 500mL | Used to stop the red blood cell lysis reaction |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E9884-100G | Used at 0.5 M |
Gentamicin sulfate | Lonza | 17-518Z | Component of harvesting solution |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS 1x) | Gibco | 14175-095 500mL | Component of harvesting solution and staining buffer solution |
Luer-Lok tip 10 mL syringe | Becton, Dickinson and Co | 309604 | Used with 26G needle to flush bones, used with 20G needle to break up clumps |
Magic touch 2 ice bucket | BelArt | M16807-2001 | Used to store the specimens on ice |
Nonfat dry milk | Apex | 20-241 | Component of Antibody Diluent |
Normal horse serum | Vector | ZE0122 | Component of Antibody Diluent |
PE anti-human CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 324206 | Dilution: 5 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE anti-mouse CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 118205 | Dilution: 3 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE mouse IgG2b, κ isotype control | Biolegend | 400313 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE rat anti-human CD49f | BD Biosciences | 555763 | Dilution: 20 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE rat IgG2am, κ Isotype control | Biolegend | 400508 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1×106 cells |
Polypropylene Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Basix | 14-955-240 | Used in the centrifuge |
Povidone-Iodine Scrub | Aplicare | 82-227 | Antiseptic used to sterilize the mice |
PrecisionGlide Needle 20G x 1 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305176 | 20G needle used to break up bone marrow clumps |
PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305111 | 26G needle used to flush bone marrow from bones |
PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Services | 63422-06 | 8 well slides cells sorted onto for immunofluorescence |
RBC Lysis buffer 10X | Invitrogen | 00-4300-54 | Dilution 1:10 using sterile deionized water |
Scissors | Roboz | RS-6762 | Used during harvest |
Stainless steel surgical blade #4 | Bard-Parker | 371222 | Used during harvest |
Sterile tray | Polar ware | 10F | Used during harvest |
StretchEase Powder-free nitrile examination gloves | Denville Scientific | G4161 | Used during harvest |
Surgical Scalpel handle #4 | Fischer | 12-000-164 | Used with surgical blade |
TBS 20x | Thermo | Component of TBST, used at 1X | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Used to count dead cells. Filtered with .45 µm |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-500mL | Component of TBST |
Tweezers | Miltex | 6-8 | Used during harvest |
Vectashield Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1800 | Nuclear stain for immunofluorescence |