Denna artikel presenterar en reproducerbar metod med nya fynd om förekomsten av epitelceller i normalt humant och musblod och benmärg med hjälp av flödescytometri och immunofluorescensmikroskopi. Krt1-14;mTmG transgena möss användes som en in vivo-metod för att bekräfta dessa fynd.
Epitelceller har identifierats i blod och benmärg hos patienter med cancer och andra sjukdomar. Förekomsten av normala epitelceller i blod och benmärg hos friska individer har dock ännu inte identifierats på ett konsekvent sätt. Här presenteras en reproducerbar metod för att isolera epitelceller från friskt humant och murint blod och benmärg (BM) med hjälp av flödescytometri och immunofluorescens (IF) mikroskopi. Epitelceller hos friska individer identifierades och isolerades först via flödescytometri med hjälp av epitelcelladhesionsmolekyl (EpCAM). Dessa EpCAM+-celler bekräftades uttrycka keratin med hjälp av immunofluorescensmikroskopi i Krt1-14;mTmG transgena möss. Humana blodprover hade 0,18% ± 0,0004 EpCAM+ celler (SEM; n = 7 biologiska replikat, 4 experimentella replikat). I human BM var 3,53% ± 0,006 (SEM; n = 3 biologiska replikat, 4 experimentella replikat) av mononukleära celler EpCAM+. I musblod utgjorde EpCAM+-celler 0,45 % ± 0,0006 (SEM; n=2 biologiska replikat, 4 experimentella replikat) och i mus BM var 5,17 % ± 0,001 (SEM; n=3 biologiska replikat, 4 experimentella replikat) EpCAM+. Hos möss var alla EpCAM+-celler immunreaktiva mot pan-cytokeratin, vilket bestämdes genom IF-mikroskopi. Resultaten bekräftades med Krt1-14; mTmG transgena möss, med låga (8,6 ursprungliga GFP + -celler per 106 analyserade celler; 0,085% av livskraftiga celler), men signifikant antal (p < 0,0005) GFP + -celler närvarande i normal murin BM, som inte var resultatet av slumpmässighet jämfört med flera negativa kontroller. Vidare var EpCAM+-celler i musblod mer heterogena än CD45+-celler (0,58% i BM; 0,13% i blod). Dessa observationer drar slutsatsen att celler som uttrycker cytokeratinproteiner är reproducerbara detekterbara bland mononukleära celler från humant och murint blod och BM. Vi demonstrerar en metod för vävnadsskörd, flödescytometri och immunfärgning som kan användas för att identifiera och bestämma funktionen hos dessa pan-cytokeratinepitelceller hos friska individer.
Epitelceller finns i de fysiska barriärerna mellan våra kroppar och miljön och kan känna igen och reagera på förändringar i deras mikromiljö1. De har en växande stamcellsnisch som ger ett sätt att vända ny vävnad och reparera skador2. Vårt laboratorium studerar stamceller i hårsäckarna i huden; Hud är en bra modell för att studera epitelvävnad och stamcellsproliferation eftersom det är lätt synligt och det finns en konstant omsättning av celler. Epitelcancer är den vanligaste formen av cancer, möjligen på grund av epitelvävnader, såsom huden, som är den första försvarslinjen mot miljöcancerframkallande ämnen, vilket leder till höga omsättningshastigheter och spridning av epitelceller3. Det mesta av hudens epidermis, det övre skyddande skiktet, består av keratinocyter, som uttrycker olika typer av keratiner för att ge stöd och struktur4. Patienter med epitelcancer har ofta epitelceller närvarande i blodet och benmärgen som också uttrycker keratiner. Flytande biopsier är ett icke-invasivt sätt att upptäcka och övervaka dessa epitelceller i olika kroppsvätskor5. Cirkulerande epitelceller, även kallade cirkulerande tumörceller (CTC), finns i perifert blod och kan vara biomarkörer för cancerprognos, samt vägleda individualiserade terapibehandlingar. CTC kan också indikera sjukdomsprogression, behandlingseffekt och total patientöverlevnad 5,6.
Epitelial cell adhesion molecule (EpCAM) är en kliniskt använd markör för CTC och kan identifiera tumörer av epitelialt ursprung hos cancerpatienter. EpCAM spelar en roll i celladhesion, migration, signalering, proliferation och differentiering6. För att en cirkulerande epitelcell ska klassificeras som CTC måste den vara positiv för cytokeratiner 8, 18 och 19 och negativ för CD45, en vanlig leukocytmarkör6. CTC identifieras vanligtvis genom att först tömma CD45 med magnetiska mikrokulor, följt av testning för EpCAM och cytokeratin 19 med användning av immunofluorescensmikroskopi7. Den huvudsakliga begränsningen vid detektering av CTC är deras sällsynthet; De utgör mindre än 0,01% av alla celler i blodet, och mycket få överlever i omlopp för att nå avlägsna organ 8,9,10. Hänsyn måste tas vid utformning av experiment och tekniker för att isolera och identifiera dessa celler på grund av deras sällsynta natur. För närvarande finns det bara en Food and Drug Administration (FDA) -godkänd automatiserad encellssorterare som används för att identifiera CTC, och den använder EpCAM som biomarkör. Andra metoder inkluderar magnetisk pärlseparation och flödescytometri, eller en kombination av dessa metoder. Det finns ett behov av nya tekniker som har högre känslighet och specificitet för detektion av sällsynta CTC11.
Flödescytometri är en föredragen metod för detektion av sällsynta cellpopulationer i blod, benmärg och andra vävnadsprover. Dessa sällsynta celler kan inkludera stamceller, cirkulerande endotelceller, CTC och kvarvarande sjukdomsceller. Flödescytometri möjliggör kvantitativa mätningar av varje celltyp och sorterar dessa celler för vidare testning 7,9. Inkrementella räkningar utfördes för att säkerställa en korrekt bedömning av dessa sällsynta celler. Möjligheten att använda grind för att utesluta celler från vidare analys är ett sätt att öka specificiteten vid analys av celler. Begränsningarna för flödescytometri är den tid som krävs för analys av stora prover och bristen på visuell bekräftelse för cellidentitet. För att övervinna detta utfördes immunofluorescensmikroskopi på de sorterade cellerna för att bekräfta deras identitet.
Tidigare har vårt labb visat att benmärgscellerna rekryteras hos möss och bidrar till hudtumörer12. Dessa benmärgshärledda celler är positiva för pan-cytokeratin och epidermalt cytokeratin. För att ytterligare belysa rollen av epiteliala stamceller, benmärgshärledda celler och cytokeratinuttryckande celler i tumörprogression letades EpCAM+ cytokeratinpositiva celler i normala murina och humana blod- och benmärgsprover. Som med de flesta experiment utvecklades denna metod genom flera iterationer. Tidigare användes transgena möss tillsammans med inkrementella räkningar för att leta efter K14GFP-uttryckande celler i benmärgen12. När fler celler räknades kunde en representativ population av sällsynta celler identifieras, vilket visas i figur 1 i avsnittet representativa resultat. Motiveringen för att undersöka epitelceller i normalt blod och benmärg baserades på tidig litteratur om CTC, där normala friska donatorer hade bakgrundsnivåer av EpCAM+ celler13. Som tidigare nämnts börjar EpCAM-karakterisering ofta med utarmningen av CD45. Detta steg utelämnades eftersom vissa hematopoetiska celler har EpCAM och cytokeratinuttryck av okända skäl som behöver undersökas ytterligare. Därför sorterades celler baserat på närvaro eller frånvaro av EpCAM, oavsett cellinje, och immunfärgades sedan för cytokeratin. Protokollet nedan och arbetsflödet som visas i figur 2 beskriver en teknik som använder flödescytometri med kompensation och kontroller, statistiska metoder och immunofluorescensavbildning för att isolera och identifiera dessa sällsynta populationer av epitelceller.
Det finns vissa bevis i litteraturen på närvaron av epitelceller i benmärgen. Tidigare har artiklar vanligtvis undersökt epitelcellernas roll i samband med sjukdom och skada, såsom i lever, lunga, mag-tarmkanalen (GI), bräss och hud14,15,16,17. Emellertid är inte mycket känt om närvaron av dessa epitelceller i benmärgen hos friska individer. Detta dokument syftar till att etablera en reproducerbar metod i syfte att identifiera och isolera epitelceller från normalt blod och benmärg. Denna metod kommer att driva fältet framåt för att identifiera varför epitelceller är närvarande och vad deras roll är i blodet och benmärgen i frånvaro av sjukdom; Kanske är dessa celler en del av normalt vävnadsunderhåll eller aktiverade vid skada. Benmärgen är ett förråd av stamceller; Det är emellertid oklart vad härstamningen av dessa epitelceller kan vara. Ett nyligen papper diskuterar benmärgshärledda epitelceller i tymus, som först uttrycker EpCAM och den hematopoetiska markören CD45 och sedan förlorar sitt CD45-uttryck över tiden efter skada15. Forskning från vårt laboratorium har också bekräftat förekomsten av CD45 + EpCAM+ -celler i friskt blod och benmärg i frånvaro av skada12. Dessa cellers roll är dock ännu inte bestämd.
Det fanns ett behov av en reproducerbar metod för att undersöka epitelceller i den friska benmärgen. Den beskrivna metoden hjälper till att karakterisera dessa celler ytterligare i sitt normala tillstånd. Det finns viktiga steg i denna metod för att upprätthålla reproducerbarheten. Ett av de mest kritiska stegen i detta protokoll är att upprätthålla en steril miljö i huven medan benmärgen skördas från möss. Vid skörd från flera möss undviks korskontaminering mellan proverna genom att använda nya nålar och sprutor för varje mus. Detta säkerställer också att provet är rent och fritt från föroreningar som kan påverka resultaten. Dessutom bör antalet beredda sprutor och märkta koniska rör för varje ytterligare mus ökas. Ett annat viktigt steg innebär att spola benen tills en ren vit färg är uppenbar för att säkerställa att de flesta benmärgscellerna har tagits bort; Chanserna att upptäcka sällsynta celler ökar i ett renare prov. En modifiering gjordes för att optimera det röda blodkroppslysprotokollet; Flera lysbuffertar testades för att hitta den rätta som gav genomgående hög livskraft, eftersom nästan hälften av cellerna förlorades under detta steg. Olika reagens och inkubationsperioder kan behöva optimeras för bättre resultat i andra inställningar.
Den mest signifikanta begränsningen av detta protokoll är att använda flödescytometri för att hitta sällsynta cellpopulationer. Som diskuterats tidigare bidrar tillägget av kontroller och inkrementella räkningar till att öka analysens specificitet och noggrannhet. En annan begränsning är att lämpliga markörer för populationen av intresse måste identifieras i förväg. Således behöver man veta om nyckelmarkörer, antikroppar för flödescytometri och antikroppar som är kompatibla med målarten.
Dessa metoder är en förbättring jämfört med befintliga metoder eftersom de möjliggör encellsanalys till en bråkdel av kostnaden för den befintliga automatiska CTC-isolatorn och encells-RNA-sekvensering. Dessutom är flödescytometri mer lättillgänglig. FACS bibehöll högre livskraft för cellerna jämfört med tidigare rapporterade resultat med magnetisk mikropärlseparation. Slutligen möjliggör dessa tekniker separation av celler för nedströmsanalyser, såsom bulk-RNA-sekvensering, scRNA-sekvensering eller cellodling.
The authors have nothing to disclose.
Josh Monts, flödescytometertekniker för kärnanläggningar, Hormelinstitutet
Todd Schuster, Core Facility Manager, The Hormel Institute
Derek Gordon, statistiker, Rutgers University
Vi vill tacka Karen Klein från Clarus Editorial Services, Santa Fe, NM för hennes redaktionella hjälp.
Detta arbete stöddes delvis av National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases vid National Institutes of Health under Award Number R21 AR075281, och ett bidrag till stöd för forskning, konstnärskap och stipendium, Office of the Vice President for Research, University of Minnesota (förslag # 324240). Vi erkänner tacksamt stöd från The Hormel Institute.
40 μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Used to filter out any large clumps of cells from bone marrow |
5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes used for flow cytometry |
500 mL jar with lid | Nalgene | 11-823-32 | Used to wash the mouse |
190 proof Ethanol | Decon laboratories Inc | 2801 | Diluted to 70% with dH2O |
Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | Dilution: 1:1000 |
Brightline Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-10 | Used to count alive cells |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | Component of antibody diluent |
Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Component of staining buffer and harvesting solution |
Curity gauze sponges | Covidien | 2187 | Used to keep a clean work area when harvesting limbs and bone marrow |
Curved Forceps | Miltex | 18-784 | Used during harvest |
Cytokeratin, Wide Spectrum Screening | Dako | Z0622 | Dilution 1:750 *Now discontinued |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS 1x) | Gibco | 14190-144 500mL | Used to stop the red blood cell lysis reaction |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E9884-100G | Used at 0.5 M |
Gentamicin sulfate | Lonza | 17-518Z | Component of harvesting solution |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS 1x) | Gibco | 14175-095 500mL | Component of harvesting solution and staining buffer solution |
Luer-Lok tip 10 mL syringe | Becton, Dickinson and Co | 309604 | Used with 26G needle to flush bones, used with 20G needle to break up clumps |
Magic touch 2 ice bucket | BelArt | M16807-2001 | Used to store the specimens on ice |
Nonfat dry milk | Apex | 20-241 | Component of Antibody Diluent |
Normal horse serum | Vector | ZE0122 | Component of Antibody Diluent |
PE anti-human CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 324206 | Dilution: 5 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE anti-mouse CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 118205 | Dilution: 3 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE mouse IgG2b, κ isotype control | Biolegend | 400313 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE rat anti-human CD49f | BD Biosciences | 555763 | Dilution: 20 µl in 100 µl per 1×106 cells |
PE rat IgG2am, κ Isotype control | Biolegend | 400508 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1×106 cells |
Polypropylene Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Basix | 14-955-240 | Used in the centrifuge |
Povidone-Iodine Scrub | Aplicare | 82-227 | Antiseptic used to sterilize the mice |
PrecisionGlide Needle 20G x 1 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305176 | 20G needle used to break up bone marrow clumps |
PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305111 | 26G needle used to flush bone marrow from bones |
PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Services | 63422-06 | 8 well slides cells sorted onto for immunofluorescence |
RBC Lysis buffer 10X | Invitrogen | 00-4300-54 | Dilution 1:10 using sterile deionized water |
Scissors | Roboz | RS-6762 | Used during harvest |
Stainless steel surgical blade #4 | Bard-Parker | 371222 | Used during harvest |
Sterile tray | Polar ware | 10F | Used during harvest |
StretchEase Powder-free nitrile examination gloves | Denville Scientific | G4161 | Used during harvest |
Surgical Scalpel handle #4 | Fischer | 12-000-164 | Used with surgical blade |
TBS 20x | Thermo | Component of TBST, used at 1X | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Used to count dead cells. Filtered with .45 µm |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-500mL | Component of TBST |
Tweezers | Miltex | 6-8 | Used during harvest |
Vectashield Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1800 | Nuclear stain for immunofluorescence |