芳香族アミノ酸によって制御される細胞代謝のバイオ直交化学イメージング
Summary
2光子励起蛍光顕微鏡(2PEF)と統合された酸化重水素(重水D2O)プローブ誘導ラマン散乱(DO-SRS)顕微鏡を使用して、アミノ酸によって制御される細胞の代謝活動を直接視覚化するプロトコルを提示します。
Abstract
必須芳香族アミノ酸(AAA)は、細胞内で新しいバイオマスを合成し、正常な生物学的機能を維持するための構成要素です。例えば、AAAの豊富な供給は、癌細胞が急速な成長と分裂を維持するために重要です。これに伴い、細胞がその 場での代謝のためにAAAをどのように利用しているかを直接視覚化するために、最小限のサンプル調製で高度に特異的で非侵襲的なイメージングアプローチに対する需要が高まっています。ここでは、酸化重水素(D2O)プロービングと誘導ラマン散乱(DO-SRS)を組み合わせた光学イメージングプラットフォームを開発し、DO-SRSと2光子励起蛍光(2PEF)を1つの顕微鏡に統合して、AAA制御下でのHeLa細胞の代謝活動を直接可視化します。DO-SRSプラットフォームは、単一のHeLa細胞ユニットで新たに合成されたタンパク質と脂質の高い空間分解能と特異性を提供します。さらに、2PEFモダリティは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)およびフラビンの自己蛍光シグナルをラベルフリーで検出できます。ここで説明するイメージングシステムは、in vitro モデルと in vivo モデルの両方に対応しており、さまざまな実験に柔軟に対応します。このプロトコルの一般的なワークフローには、細胞培養、培地調製、細胞同期、細胞固定、およびDO-SRSおよび2PEFモダリティによるサンプルイメージングが含まれます。
Introduction
必須の芳香族アミノ酸(AAA)であるフェニルアラニン(Phe)とトリプトファン(Tryp)は、人体に吸収されて、正常な生物学的機能を維持するための新しい分子を合成することができます1。Pheはタンパク質、メラニン、チロシンの合成に必要であり、Trypはメラトニン、セロトニン、ナイアシンの合成に必要です2,3。しかし、これらのAAAの過剰摂取は、ラパマイシン(mTOR)経路の哺乳類標的をアップレギュレートし、AMP活性化プロテインキナーゼを阻害し、ミトコンドリア代謝を妨害し、高分子生合成を集合的に変化させ、健康な細胞における活性酸素種(ROS)などの悪性前駆体の産生につながる可能性があります4,5,6.過剰なAAA調節下での変化した代謝動態の直接的な可視化は、がんの発生と健康な細胞の成長を促進するAAAの役割を理解するために不可欠です7,8,9。
従来のAAA研究は、ガスクロマトグラフィー(GC)10に依存しています。磁気共鳴画像法(MRI)などの他の方法は、空間分解能が制限されており、生物学的試料の細胞および細胞内分析を行うことを困難にしている11。最近、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)が開発され、非侵襲的バイオマーカーを用いて癌増殖における脂質およびタンパク質合成におけるAAAの役割を解明しました12,13,14。ただし、この手法では、イメージング深度が浅く、空間分解能が低く、サンプル調製が不十分です。細胞レベルでは、窒素15や炭素13などの無毒の安定同位体をマルチ同位体イメージングとナノスケールの二次イオン質量分析で追跡し、高分子への取り込みを理解することができます。しかしながら、これらの方法は、生きた生物学的試料に対して破壊的である15、16。原子間力顕微鏡(AFM)は、代謝動態を視覚化できるもう17つの強力な技術です。一方、AFMイメージング中のスキャン速度が遅いと、熱ドリフトによる結果の画像歪みが発生する可能性があります。
我々は、酸化重水素(D2O)プローブ誘導ラマン散乱(DO-SRS)顕微鏡とラベルフリー2光子励起蛍光顕微鏡(2PEF)を組み合わせることにより、非侵襲的な双直交イメージングモダリティを開発しました。このモダリティは、生物学的試料を画像化する際に高い空間分解能および化学的特異性を達成する18、19、20、21、22、23、24。このプロトコルでは、がんの進行に伴う脂質、タンパク質、および酸化還元比の変化の代謝動態を調べるためのDO-SRSおよび2PEFのアプリケーションを紹介します。D2Oは水の安定同位体形態であり、細胞内の全身水分との迅速な補償により、細胞生体分子は重水素(D)で標識され、酵素交換を介して炭素-重水素(C-D)結合を形成することができる21。脂質、タンパク質、DNA/RNA、炭水化物など、新たに合成された高分子のC-D結合は、ラマンスペクトル20,21,22,25,26,27の細胞サイレント領域で検出できます。2つの同期レーザーパルスにより、新たに合成された脂質とタンパク質のC-D結合を、細胞毒性物質で抽出または標識することなく、ハイパースペクトルイメージング(HSI)を介して単一細胞上に表示できます。加えて、SRS顕微鏡は、一組の断面画像を捕捉して組み合わせることによって、生物学的試料中の選択された関心領域の3次元(3D)モデルを構築する能力を有する22、26。ハイパースペクトルおよび3D体積イメージングにより、DO-SRSは、AAA規制22の下で癌の成長を促進するプロセスを促進する細胞小器官のタイプとともに、単一細胞で新しく合成された高分子の空間分布を取得できます。さらに、2PEFを使用すると、生体サンプル中のフラビンおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)の自己蛍光シグナルを、高分解能、深い浸透深さ、および低レベルの損傷で取得できます21、23、24。フラビンおよびNADHの自己蛍光シグナルは、癌細胞における酸化還元恒常性および脂質過酸化を特徴付けるために使用されています22,26。このように、DO-SRSと2PEFのカップリングは、高い空間分布、化学的特異性情報、および最小限のサンプル調製で、癌細胞におけるAAA調節代謝動態の細胞内分析を提供するだけでなく、内因性分子を毒性試薬で抽出または標識する必要性も低減します。このプロトコールでは、まずD2Oおよびアミノ酸調製、ならびに癌細胞培養の手順を提示する。次に、DO-SRSイメージングと2PEFイメージングのプロトコルを示します。最後に、AAA制御による脂質やタンパク質の代謝変化、がん細胞の酸化還元比変化などを示すSRSと2PEFイメージングの代表的な結果を紹介します。このプロセスの詳細な図を図 1 に示します。
Protocol
1. 培地調製 50Oを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に10mLのコントロールおよび過剰のAAAを調製する。コントロール培地については、15 mLのコニカルチューブで10 mgのDMEM粉末を4.7 mLの二重蒸留水(ddH2O)と測定して混合します。DMEM粉末には、標準濃度のすべてのアミノ酸が含まれています。チューブを完全にボルテックスして反転させ、溶液がよく?…
Representative Results
50O含有細胞培養培地に15倍の濃度で過剰のAAAを添加すると、HeLa細胞において新たに合成された脂質およびタンパク質の明確なC-Dラマンバンドが生じた(図2B)。以前の実験は、2倍や5倍などの異なる濃度レベルで行われ、データは提示されていませんが、15倍の濃度は、新しく合成された脂質とタンパク質の最も明確なC-Dラマンバンドを生成しました。具体的には…
Discussion
DO-SRSおよび2PEFイメージングは、ショウジョウバエおよびヒト組織を含む様々なex vivoモデルにおける代謝動態を調べるために適用されている21,22,23,24,26,27,33。この研究で使用されたイメージングモダリティは、DO-…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
技術サポートを提供してくださったYajuan Li博士とAnthony Fung博士、そして細胞株を提供してくれたFraleyラボに感謝します。UCSD、NIH U54CA132378、NIH 5R01NS111039、NIH R21NS125395、NIHU54DK134301、NIHU54 HL165443、ヘルマンフェロー賞からのスタートアップ資金に感謝します。
Materials
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer – Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer – Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme – Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
Referências
- Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
- Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. Metabolism of amino acids in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837 (2020).
- Parthasarathy, A., et al. A three-ring circus: Metabolism of the three proteogenic aromatic amino acids and their role in the health of plants and animals. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 29 (2018).
- Wang, H., et al. l-tryptophan activates mammalian target of rapamycin and enhances expression of tight junction proteins in intestinal porcine epithelial cells. The Journal of Nutrition. 145 (6), 1156-1162 (2015).
- Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
- Mossmann, D., Park, S., Hall, M. N. mTOR signalling and cellular metabolism are mutual determinants in cancer. Nature Reviews. Cancer. 18 (12), 744-757 (2018).
- Kimura, T., Watanabe, Y. Tryptophan protects hepatocytes against reactive oxygen species-dependent cell death via multiple pathways including Nrf2-dependent gene induction. Amino Acids. 48 (5), 1263-1274 (2016).
- Ma, Q., et al. Dietary supplementation with aromatic amino acids decreased triglycerides and alleviated hepatic steatosis by stimulating bile acid synthesis in mice. Food and Function. 12 (1), 267-277 (2021).
- Cheng, C., et al. Treatment implications of natural compounds targeting lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease, obesity and cancer. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1654-1663 (2019).
- Lubes, G., Goodarzi, M. GC-MS based metabolomics used for the identification of cancer volatile organic compounds as biomarkers. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 313-322 (2018).
- Di Gialleonardo, V., Wilson, D. M., Keshari, K. R. The potential of metabolic imaging. Seminars in Nuclear Medicine. 46 (1), 28-39 (2016).
- Bowman, A. P., et al. Evaluation of lipid coverage and high spatial resolution MALDI-imaging capabilities of oversampling combined with laser post-ionisation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2277-2289 (2020).
- Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M. Imaging of lipid species by MALDI mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 50, 317-322 (2009).
- Pirman, D. A., et al. Changes in cancer cell metabolism revealed by direct sample analysis with MALDI mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), e61379 (2013).
- Li, Z., et al. Single-cell lipidomics with high structural specificity by mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 2869 (2021).
- Miyagi, M., Kasumov, T. Monitoring the synthesis of biomolecules using mass spectrometry. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 374 (2079), 20150378 (2016).
- Wang, T., Shogomori, H., Hara, M., Yamada, T., Kobayashi, T. Nanomechanical recognition of sphingomyelin-rich membrane domains by atomic force microscopy. Bioquímica. 51 (1), 74-82 (2012).
- Fung, A. A., Shi, L. Mammalian cell and tissue imaging using Raman and coherent Raman microscopy. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 12 (6), e1501 (2020).
- Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 11 (3), 1078-1101 (2021).
- Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
- Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
- Bagheri, P., Hoang, K., Fung, A. A., Hussain, S., Shi, L. Visualizing cancer cell metabolic dynamics regulated with aromatic amino acids using DO-SRS and 2PEF microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 779702 (2021).
- Li, Y., et al. Direct imaging of lipid metabolic changes in drosophila ovary during aging using DO-SRS microscopy. Frontiers in Aging. 2, 819903 (2022).
- Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of metabolic dynamics in aging Drosophila. Analyst. 146 (24), 7510-7519 (2021).
- Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
- Fung, A. A., et al. Imaging sub-cellular methionine and insulin interplay in triple negative breast cancer lipid droplet metabolism. Frontiers in Oncology. 12, 858017 (2022).
- Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of diet regulated metabolic activities in Drosophila during aging processes. Aging Cell. 21 (4), e13586 (2022).
- Shi, L., Wei, M., Min, W. Highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes. Journal of Visualized Experiments. (182), e63547 (2022).
- Rysman, E., et al. De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation. Pesquisa do Câncer. 70 (20), 8117-8126 (2010).
- Lisec, J., Jaeger, C., Rashid, R., Munir, R., Zaidi, N. Cancer cell lipid class homeostasis is altered under nutrient-deprivation but stable under hypoxia. BMC Cancer. 19 (1), 501 (2019).
- Thiam, A. R., Dugail, I. Lipid droplet-membrane contact sites – from protein binding to function. Journal of Cell Science. 132 (12), (2019).
- Schott, M. B., et al. Lipid droplet size directs lipolysis and lipophagy catabolism in hepatocytes. The Journal of Cell Biology. 218 (10), 3320-3335 (2019).
- Hoang, K., et al. Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis. Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).
- Jang, H., et al. Super-resolution stimulated Raman scattering microscopy with A-PoD. bioRxiv. , (2022).
- Li, Y., et al. Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain. bioRxiv. , (2022).
- Zhang, W., et al. Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS imaging. bioRxiv. , (2022).
- Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).
- Chang, T., et al. Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy. Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).
- Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope – Label Free Imaging. Leica Microsystems Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/ (2023)
Citar este artigo
Bagheri, P., Hoang, K., Kuo, C., Trivedi, H., Jang, H., Shi, L. Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids. J. Vis. Exp. (195), e65121, doi:10.3791/65121 (2023).