Apresentamos um protocolo para visualizar diretamente as atividades metabólicas em células reguladas por aminoácidos usando microscopia Raman estimulada de espalhamento Raman estimulado com óxido de deutério (água pesada D2O) (DO-SRS), que é integrada à microscopia de fluorescência por excitação de dois fótons (2PEF).
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Artigo de método
Imagem Química Bioortogonal do Metabolismo Celular Regulado por Aminoácidos Aromáticos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Aminoácidos aromáticos essenciais (AAAs) são blocos de construção para sintetizar novas biomassas em células e sustentar funções biológicas normais. Por exemplo, um suprimento abundante de AAAs é importante para que as células cancerosas mantenham seu rápido crescimento e divisão. Com isso, há uma demanda crescente por uma abordagem de imagem altamente específica, não invasiva, com preparação mínima da amostra para visualizar diretamente como as células aproveitam os AAAs para seu metabolismo in situ. Aqui, desenvolvemos uma plataforma de imagem óptica que combina sondagem de óxido de deutério (D2O) com espalhamento Raman estimulado (DO-SRS) e integra DO-SRS com fluorescência de excitação de dois fótons (2PEF) em um único microscópio para visualizar diretamente as atividades metabólicas das células HeLa sob regulação AAA. Coletivamente, a plataforma DO-SRS fornece alta resolução espacial e especificidade de proteínas e lipídios recém-sintetizados em unidades únicas de células HeLa. Além disso, a modalidade 2PEF pode detectar sinais de autofluorescência de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) e Flavina de forma livre de marcação. O sistema de imagem aqui descrito é compatível com modelos in vitro e in vivo , o que é flexível para vários experimentos. O fluxo de trabalho geral deste protocolo inclui cultura celular, preparação de meios de cultura, sincronização celular, fixação celular e imagem de amostra com as modalidades DO-SRS e 2PEF.
Introdução
Sendo aminoácidos aromáticos essenciais (AAAs), fenilalanina (Phe) e triptofano (Tryp) podem ser absorvidos pelo organismo humano para sintetizar novas moléculas para sustentar funções biológicas normais1. Phe é necessário para a síntese de proteínas, melanina e tirosina, enquanto Tryp é necessário para a síntese de melatonina, serotonina, e niacina 2,3. No entanto, o consumo excessivo desses AAAs pode regular o alvo mamífero da via da rapamicina (mTOR), inibir a proteína quinase ativada por AMP e interferir no metabolismo mitocondrial, alterando coletivamente a biossíntese de macromolé....
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Protocolo
1. Preparação da mídia
- Preparar 10 mL de AAAs controle e excesso em meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco contendo 50% D2O.
- Para o meio controle, medir e misturar 10 mg de pó de DMEM com 4,7 mL de água bidestilada (ddH2O) em um tubo cônico de 15 mL. O pó de DMEM contém todos os aminoácidos em concentrações padrão. Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada. Adicionar 4,7 mL de D2O, 0,5 mL de soro fetal bovino (SFB a 5%) e 0,1 mL de penicilina/estreptomicina (1%). Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada. ....
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Resultados
A adição do excesso de AAAs em concentrações de 15x aos meios de cultura celular contendo 50% D2O produziu bandas Raman C-D distintas de lipídios e proteínas recém-sintetizados em células HeLa (Figura 2B). Experimentos anteriores foram realizados com diferentes níveis de concentração, como 2x e 5x, e embora os dados não sejam apresentados, a concentração de 15x produziu as mais distintas bandas Raman C-D de lipídios e proteínas recém-sintetizados. Especificamente, investigando got.......
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Discussão
DO-SRS e 2PEF têm sido aplicados para investigar a dinâmica metabólica em vários modelos ex vivo, incluindo Drosophila e tecidos humanos 21,22,23,24,26,27,33. A modalidade de imagem usada neste estudo integra a microscopia DO-SRS e 2PEF, que pode superar outros métodos de imagem esp.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Yajuan Li e Anthony Fung por seu suporte técnico e ao laboratório Fraley pela linha celular. Agradecemos os fundos iniciais da UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 e Hellman Fellow Award.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pipetas sorológicas de 10 mL | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| Tubo de centrífuga cónico de 15 mL | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% de formaldeído, sem metanol | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| placa | de 24 poçosFiltro | Fisherbrand FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm, 2 μ m PES Foxx | Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Cubo de Filtro | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| Adaptadores CA da Fonte de Alimentação para LD OBIS 6 Laser Remoto | Olympus | Forneça energia para o laser | |
| Filtro passa-banda | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| Terminador BNC 50 Ohm | Mini Circuitos | STRM-50 | |
| Cabo BNC | Thorlabs | 2249-C | Cabo Coaxial, BNC Macho/Macho |
| Espelho Dielétrico de Banda Larga | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| Condensador Centrífuga | |||
| Olympus | |||
| Vidro de Cobertura | Corning | 2850-25 | Fonte de |
| alimentação DC | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Águia Modificada de Dulbecco' s Meio sem Metionina, Treonina e Piruvato de Sódio | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder Com Bicarbonato de Sódio e sem Metionina, Treonina e Piruvato de Sódio |
| Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Versão 1.53t 24 de agosto de 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Água Pesada (Óxido de Deutério) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocímetro | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB& gclsrc=aw.ds |
| Filtro passa-banda de alto diâmetro externo | Chroma Technology | ET890/220m | Filtre o feixe de Stokes e transmita o feixe da bomba |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Tripsina 0,25% (1x) Solução | Cytiva | SH30042,02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Sistema de Laser SRS Integrado | Física Aplicada & Eletrônica, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD fornece um pulso de saída a 1031 nm com largura de pulso de 6 ps e taxa de repetição de 80 MHz, que serve como feixe de Stokes. O feixe de frequência dobrada a 532 nm é usado para semear de forma síncrona um oscilador paramétrico óptico de picossegundo (OPO) para produzir um trem de pulso bloqueado por modo com largura de pulso de cinco ~ 6 ps (o feixe intermediário do OPO é bloqueado com um filtro interferométrico). O comprimento de onda de saída do OPO é ajustável a partir de 720– 950 nm, que serve como feixe da bomba. A intensidade do feixe de Stokes de 1031 nm é modulada senoidalmente por um EOM embutido a 8 MHz com uma profundidade de modulação de mais de 90%. O feixe da bomba é espacialmente sobreposto ao feixe de Stokes usando um espelho dicróico dentro do picoEMERALD. A sobreposição temporal entre a bomba e os pulsos de Stokes é alcançada com um estágio de atraso embutido e otimizada pelo sinal SRS de D2O puro no microscópio. |
| Microscópio de varredura a laser invertido | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Caixa de controle | Olympus | Controle o microscópio de varredura a laser | |
| Montagem de espelho cinemático | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Ajustadores hexagonais de baixo perfil |
| L-fenalinina | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Triptofano | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Amplificador Lock-In | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Divisor de feixe dicróico de longa duração | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine dicroico de borda única a laser-divisor de feixe dicroico plano |
| MATLAB | MathWorks | Versão: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| lâminas de microscópio | Fisherbrand | 12-550-003 | Software de |
| Microscopia de Imagem | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[foco]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[foco]=cmsContent11363 |
| Condensador de Óleo NA | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Esmalte | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origem | OriginLab | Origem 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Termofischer de Penicilina/Estreptomicina | - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Montagem de Periscópio | Thorlabs | RS99 | Inclui as unidades superior e inferior, Ø Poste de 1" e garfo de fixação. |
| Sistema picoEmerald | A.P.E | N/A | |
| Caixa blindada com conectores BNC | Pomona Electronics | 2902 | BNC fêmea/fêmea Si Espaçadores |
| wafer | |||
| N/A | DYI | construídos em casa | |
| Grace | Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Espectroscopia Raman espontânea | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Microscopia de Espalhamento Raman Estimulada | Home Built | N/A | |
| Touch Controlador de Painel | Olympus | Controle a direção X-Y do microscópio de varredura a laser | |
| Azul de Tripano 0,4% (0,85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Pinças | Kaverme - Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Microscopia de Fluorescência de Excitação de Dois Fótons | N/A | Construído em Casa | |
| VWR | 12578-165 | ||
| https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Controla o amplificador de bloqueio Zurich |
Referências
- Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
- Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. Metabolism of amino acids in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837(2020).
- Parthasarathy, A., et al.
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Reimpressões e permissões
