Descrevemos um protocolo para isolar e cultivar células endoteliais da veia safena humana (hSVECs). Também fornecemos métodos detalhados para produzir tensão de cisalhamento e alongamento para estudar tensões mecânicas em hSVECs.
A cirurgia de revascularização miocárdica (CRM) é um procedimento para revascularizar o miocárdio isquêmico. A veia safena continua sendo utilizada como conduto de revascularização miocárdica, apesar da reduzida perviedade a longo prazo em relação aos condutos arteriais. O aumento abrupto do estresse hemodinâmico associado à arterialização do enxerto resulta em dano vascular, principalmente endotélio, que pode influenciar na baixa patência da ponte de veia safena (EVS). Descrevemos o isolamento, caracterização e expansão das células endoteliais da veia safena humana (HCSV). As células isoladas por digestão da colagenase exibem a morfologia típica do paralelepípedo e expressam marcadores de células endoteliais CD31 e VE-caderina. Para avaliar a influência das tensões mecânicas, protocolos foram utilizados neste estudo para investigar os dois principais estímulos físicos, tensão de cisalhamento e estiramento, em EVS arterializadas. As HVEs são cultivadas em uma câmara de fluxo de placa paralela para produzir tensão de cisalhamento, mostrando alinhamento na direção do fluxo e aumento da expressão de KLF2, KLF4 e NOS3. hSVECs também podem ser cultivados em uma membrana de silicone que permite o estiramento celular controlado mimetizando estiramento venoso (baixo) e arterial (alto). O padrão de F-actina das células endoteliais e a secreção de óxido nítrico (NO) são modulados de acordo com o estiramento arterial. Em resumo, apresentamos um método detalhado para isolar as HVECs para estudar a influência do estresse mecânico hemodinâmico em um fenótipo endotelial.
A disfunção das células endoteliais (CE) é peça-chave na falência do enxerto de veia safena 1,2,3,4. O aumento sustentado do shear stress e do estiramento cíclico induz o fenótipo pró-inflamatório das células endoteliais da veia safena humana (hSVECs)3,4,5,6. As vias moleculares subjacentes ainda não são totalmente compreendidas, e protocolos padronizados para estudos in vitro podem alavancar os esforços para novos insights na área. Aqui, descrevemos um protocolo simples para isolar, caracterizar e expandir as HVECs e como expô-las a níveis variáveis de tensão de cisalhamento e estiramento cíclico, mimetizando as condições hemodinâmicas venosas e arteriais.
As hSVECs são isoladas por incubação da colagenase e podem ser utilizadas até a passagem 8. Esse protocolo requer menor manipulação do vaso em comparação com os outros protocolosdisponíveis7, o que reduz a contaminação com células musculares lisas e fibroblastos. Por outro lado, é necessário um segmento de vaso maior, de pelo menos 2 cm, para que a extração do CE seja eficiente. Na literatura, tem sido relatado que CEs de grandes vasos também podem ser obtidas por remoçãomecânica7,8. Embora eficaz, a abordagem física tem como desvantagens o baixo rendimento da CE e a maior contaminação por fibroblastos. Para aumentar a pureza, são necessários passos extras utilizando esferas magnéticas ou triagem celular, aumentando o custo do protocolo devido à aquisição de esferas e anticorpos 7,8. O método enzimático apresenta resultados mais rápidos e melhores quanto à pureza e viabilidade da CE 7,8.
As CE mais utilizadas para o estudo da disfunção endotelial são as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Sabe-se que o fenótipo da CE se altera nos diferentes leitos vasculares, sendo essencial o desenvolvimento de métodos que representem o vaso sobinvestigação9,10. Nesse sentido, o estabelecimento de um protocolo para isolar uma EVSS e cultivá-la sob estresse mecânico é uma ferramenta valiosa para entender a contribuição da disfunção da VExs na doença do enxerto venoso.
O segmento da veia safena deve ter pelo menos 2 cm para isolar com sucesso as HCSV. Pequenos segmentos são difíceis de manusear e amarrar as extremidades do vaso para manter a solução de colagenase para isolar as células. A área luminal reduzida não produz células suficientes para expandir a cultura. Para minimizar o risco de contaminação com não-CE, a manipulação do segmento da veia safena precisa ser muito suave durante todo o procedimento. É importante ter cuidado ao introduzir as pontas da pipeta nas su…
The authors have nothing to disclose.
O JEK é apoiado por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 e 2013/17368-0] e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 e 309179/2013-0). A AAM é apoiada por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal – 407911/2021-9).
0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
Phalloidin – Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
Phalloidin – Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |