Isolering av humana endotelceller i saphenös ven och exponering för kontrollerade nivåer av skjuvspänning och sträckning
Summary
Vi beskriver ett protokoll för att isolera och odla humana saphenösa venendotelceller (hSVEC). Vi tillhandahåller också detaljerade metoder för att producera skjuvspänning och stretch för att studera mekanisk spänning i hSVEC.
Abstract
Koronar bypass-transplantation (CABG) kirurgi är ett förfarande för att revaskularisera ischemiskt myokardium. Saphenös ven används fortfarande som en CABG-ledning trots den minskade långsiktiga patencyen jämfört med arteriella ledningar. Den plötsliga ökningen av hemodynamisk stress i samband med transplantatarterialiseringen resulterar i vaskulär skada, särskilt endotelet, som kan påverka den låga patencyen hos saphenous ventransplantat (SVG). Här beskriver vi isolering, karakterisering och expansion av humana saphenösa venendotelceller (hSVEC). Celler isolerade genom kollagenassmältning visar den typiska kullerstensmorfologin och uttrycker endotelcellmarkörer CD31 och VE-cadherin. För att bedöma den mekaniska stresspåverkan användes protokoll i denna studie för att undersöka de två huvudsakliga fysiska stimuli, skjuvspänning och sträckning, på arterialiserade SVG. hSVEC odlas i en parallell plattflödeskammare för att producera skjuvspänning, vilket visar inriktning i flödesriktningen och ökat uttryck av KLF2, KLF4 och NOS3. hSVEC kan också odlas i ett kiselmembran som möjliggör kontrollerad cellulär stretch, efterliknar venös (låg) och arteriell (hög) stretch. Endotelcellernas F-aktinmönster och kväveoxid (NO) utsöndring moduleras följaktligen av arteriell sträcka. Sammanfattningsvis presenterar vi en detaljerad metod för att isolera hSVEC för att studera påverkan av hemodynamisk mekanisk stress på en endotelfenotyp.
Introduction
Endotelcell (EC) dysfunktion är en nyckelspelare i saphenous ven transplantat misslyckande 1,2,3,4. Den ihållande ökningen av skjuvspänning och cyklisk stretch inducerar den proinflammatoriska fenotypen av humana saphenösa venendotelceller (hSVEC)3,4,5,6. De underliggande molekylära vägarna är fortfarande inte helt förstådda, och standardiserade protokoll för in vitro-studier kan utnyttja ansträngningarna för nya insikter inom området. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för att isolera, karakterisera och expandera hSVEC och hur man utsätter dem för varierande nivåer av skjuvspänning och cyklisk sträckning, vilket efterliknar de venösa och arteriella hemodynamiska tillstånden.
hSVEC isoleras genom kollagenasinkubation och kan användas fram till passage 8. Detta protokoll kräver mindre manipulation av kärlet jämfört med de andra tillgängliga protokollen7, vilket minskar kontaminering med glattmuskelceller och fibroblaster. Å andra sidan krävs det ett större kärlsegment på minst 2 cm för att ha effektiv EC-extraktion. I litteraturen har det rapporterats att EC från stora fartyg också kan erhållas genom mekaniskt avlägsnande 7,8. Även om det fysiska tillvägagångssättet är effektivt har det nackdelar som låg EC-avkastning och högre fibroblastkontaminering. För att öka renheten behövs extra steg med magnetiska pärlor eller cellsortering, vilket ökar kostnaden för protokollet på grund av förvärv av pärlor och antikroppar 7,8. Den enzymatiska metoden ger snabbare och bättre resultat avseende EC renhet och livskraft 7,8.
De vanligaste EC: erna för att studera endoteldysfunktion är humana navelvenendotelceller (HUVEC). Det är känt att EG-fenotypen förändras i olika kärlbäddar, och det är viktigt att utveckla metoder som representerar det kärl som undersöks 9,10. I detta avseende är upprättandet av ett protokoll för att isolera en hSVEC och odla den under mekanisk belastning ett värdefullt verktyg för att förstå bidraget från hSVEC-dysfunktion vid ventransplantatsjukdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det saphenösa vensegmentet bör ha varit minst 2 cm för att framgångsrikt isolera hSVEC. Små segment är svåra att hantera och binda ändarna av kärlet för att bibehålla kollagenaslösningen för att isolera cellerna. Den reducerade luminala ytan ger inte tillräckligt med celler för att expandera kulturen. För att minimera risken för kontaminering med icke-ECs måste manipuleringen av det saphenösa vensegmentet vara mycket försiktig under hela proceduren. Det är viktigt att vara försiktig när pipettspets…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JEK stöds av bidrag från Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 och 2013/17368-0] och Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 och 309179/2013-0). AAM stöds av bidrag från Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) och Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal – 407911/2021-9).
Materials
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
Referências
- Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
- Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
- Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
- Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).
- Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
- Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).
- Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
- Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413 (2020).
- Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
- Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
- Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
- Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).
