Denne metode beskriver indkapslingen af rabiesantigenet i bionedbrydelige polymere mikropartikler med strukturelle og materielle egenskaber, der muliggør pulserende frigivelse efter en forudbestemt forsinkelse. Vurdering af enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) af antigenet udtaget fra partikelkernen bekræfter tilstedeværelsen af intakt trimerisk rabiesvirusglycoprotein gennem partikelfabrikation.
De nuværende retningslinjer for rabiesprofylakse efter eksponering kræver flere injektioner administreret over flere uger. Dette kan være uforholdsmæssigt byrdefuldt for dem, der bor i lav- og mellemindkomstlande (LMIC’er), hvor størstedelen af dødelige eksponeringer for rabies forekommer. Forskellige lægemiddelleveringsstrategier er blevet undersøgt for at kondensere vaccineregimer til en enkelt injektion ved at indkapsle antigener i polymere partikler. Imidlertid kan hårde stressorer under indkapslingsprocessen forårsage denaturering af det indkapslede antigen. Denne artikel beskriver en metode til indkapsling af rabiesvirus (RABV) antigen i polymere mikropartikler, der udviser justerbar pulsatil frigivelse. Denne metode, kaldet partikler ensartet flydende og forseglet til indkapslingsmedicin (PULSED), genererer mikropartikler ved hjælp af blød litografi til at skabe inverse polydimethylsiloxan (PDMS) forme fra en multi-foton, 3D-trykt masterform. Poly (mælkesyre-co-glycolsyre) (PLGA) film komprimeres derefter i PDMS-formene for at generere åbne cylindre, der er fyldt med koncentreret RABV ved hjælp af en piezoelektrisk dispenseringsrobot. Disse mikrostrukturer forsegles derefter ved opvarmning af toppen af partiklerne, hvilket gør det muligt for materialet at strømme og danne en kontinuerlig, ikke-porøs polymerbarriere. Efter fremstillingen anvendes et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA), der er specifikt til påvisning af intakt trimerisk rabiesvirusglycoprotein, til at bekræfte den høje genopretning af immunogent antigen fra mikropartiklerne.
Vaccination er et ekstremt effektivt sundhedsværktøj, der har forhindret mere end 37 millioner dødsfald mellem 2000 og 20191. På trods af denne effektivitet udgør sygdomme, der kan forebygges ved vaccination, fortsat en betydelig risiko for den globale sundhed, især i lav- og mellemindkomstlande (LMIC’er), hvor høje arbejdsløsheds- og undervaccinationsrater bidrager til 1,5 millioner dødsfald, der kan forebygges ved vaccination, årligt2. Rabies er ingen undtagelse fra disse forskelle. På trods af sin status som den mest dødelige sygdom, menneskeheden kender, er næsten universelt dødelig, er rabies fuldt behandlet og klassificeres som udryddet i mange højindkomstlande. I stedet bæres byrden af rabies uforholdsmæssigt af mennesker, der bor i dele af Asien og Afrika, hvor sygdommen har ødelæggende resultater for mennesker og husdyr 3,4.
Vaccination er afgørende for håndteringen af rabies’ globale virkninger5. Omkostningerne ved vaccination forbyder udbredt implementering af profylakse før eksponering (PrEP) i betragtning af den samlede lave forekomst af sygdommen. Desuden er nytten af profylakse efter eksponering (PEP) i LMIC’er begrænset af socioøkonomisk pres på patienter, der søger sundhedspleje. Logistiske faktorer, såsom rejseafstand til sundhedsadgangspunkter, tabt arbejdsfortjeneste under behandling, behandlingsomkostninger, aftaler, der forstyrrer daglige aktiviteter og glemsomhed, resulterer i PEP-overholdelse så lave som 60%6,7. Denne høje patientnedslidningsrate giver mulighed for at forfine tilgange til at afhjælpe huller i rabiesvaccination for at bekæmpe sygdommen.
Enkeltinjektionsvaccinationssystemer (SI), der styrer frigivelsen af antigener, er blevet undersøgt som måder at opnå fuld immunisering i en injektion. Eliminering af behovet for flere besøg hos en sundhedsudbyder mindsker de byrder, der forhindrer enkeltpersoner i at søge tilstrækkelig pleje. For at opnå SI-vaccination indkapsles et antigen typisk i en biologisk nedbrydelig polymermatrix, der ofte har form af injicerbare mikropartikler. Når den er injiceret, nedbrydes polymeren og frigiver det sekvestrerede antigen. Til dato er to primære frigivelsesstrategier blevet forfulgt for at opnå SI-vaccination. I en tilgang frigives antigenet kontinuerligt over en længere periode. Selv om hensigten er at forbedre immunogeniciteten af en enkelt injektion, er det uklart, om denne fremgangsmåde er tilstrækkelig til at fremkalde et beskyttende immunrespons mod rabiesvirus (RABV) hos mennesker8. I den anden frigives antigenet efter en forudbestemt forsinkelse for at efterligne et konventionelt og bevist prime-boost-vaccineregime. Spraytørring og emulsion / opløsningsmiddelfordampningsbaserede mikropartikelfabrikationsmetoder udviser den tidligere strategi og er blevet brugt til med succes at indkapsle både modelvacciner9 og meget stabile antigener, såsom stivkrampetoksoid10. Disse indkapslingsmetoder involverer imidlertid stressorer, herunder varme, opløsningsmiddelinteraktion og fysiske kræfter, der kan denaturere antigener11.
Partikler ensartet flydende og forseglet til indkapslingsmedicin (PULSED) er en nyligt udviklet fabrikationsmetode, der kan anvendes til at indkapsle biologiske lægemidler i biologisk nedbrydelige mikropartikler. Mikrostøbning bruges til at generere partikler, der er fyldt med en flydende nyttelast og opvarmet for at tillade polymeren at reflow og fuldt ud indkapsle det centrale lager af last inden for et sammenhængende lag af den biologisk nedbrydelige polymer. Denne mikrostruktur resulterer i pulserende frigivelse af nyttelasten efter en varighed, der afhænger af nedbrydningshastigheden af den polymere skal12. Dette manuskript demonstrerer indkapslingen af inaktiveret RABV i mikropartikler sammensat af poly(mælkesyre-co-glycolsyre) (PLGA), en biologisk nedbrydelig polymer, der anvendes i mange FDA-godkendte formuleringer13, ved hjælp af PULSED-fabrikationsmetoden til at indkapsle stabilt RABV-antigen som evalueret ved et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA). Ved at kombinere PLGA-partikler med forskellige molekylvægt- og/eller slutgrupper har denne tilgang potentialet til at efterligne det nuværende rabiesvaccinationsforløb efter en enkelt injektion.
Det er muligt at ændre partikelgeometri til specifikke behov; For cylindriske strukturer anbefaler forfatterne imidlertid at opretholde et forhold på 5: 4: 1 af højden: diameter: vægtykkelse beskrevet i protokollen. Dette billedformat sikrer, at der er nok PLGA-materiale til stede til at forsegle partiklerne og forblive mekanisk robust nok til håndtering. Partikeldimensioner og former kan let ændres under CAD-processen, hvilket gør det muligt at generere et utal af geometrier. Ved at kombinere CAD’s fleksibilitet med 3D-udskrivning muliggøres hurtig iteration af mikropartikeldesign. Selvom denne protokol bruger en multi-foton 3D-printer, kan enhver 3D-printer med specifikationer, der er i stand til at udskrive mikrostrukturdimensionerne i et passende materiale, bruges til at generere den oprindelige masterform. Endvidere er fotolitografi tidligere blevet brugt til at gøre lignende strukturer i arrays meget større end dem, der produceres i denne protokol; Imidlertid ville arbejdet, forsinkelsen med at bestille specialfremstillede fotomasker og udstyrets tilgængelighed bremse den iterative designproces16. Endelig kan masterformgenerering outsources til gebyr-for-service-virksomheder, hvis intern masterformfremstilling ikke er mulig. Uanset hvilken 3D-printer eller metode, der bruges til at generere masterformene, er vedhæftningen af printet til underlaget kritisk for nedstrømstrin. Specifikt, hvis vedhæftningen er utilstrækkelig under PDMS-formgenerering, forbliver trykte partikler anbragt i PDMS-formen, hvilket kræver manuel fjernelse af de trykte partikler og ødelæggelse af masterformen.
Partikelfyldning er et andet kritisk aspekt at overveje. Mikropartikler har begrænset påfyldningskapacitet, så filtrering bruges ikke kun til at koncentrere RABV-antigenet, men også til at fjerne stamhjælpestoffer, der ellers ville optage en stor del af mikropartikelkernevolumenet. I betragtning af RABV-antigenets store størrelse (ca. 60 nm x 180 nm)17 er det imidlertid muligt delvist at pelletere antigenet under centrifugeringstrinnene. Det er derfor vigtigt at resuspendere antigenet ved pipettering eller hvirveldannelse efter centrifugering for at opnå en høj genfinding af RABV-antigenet. En stærkt koncentreret opløsning er ideel til dispensering, fordi den reducerer doseringscyklusserne og derved begrænser antigennedbrydning under påfyldning. Viskositet er imidlertid en væsentlig begrænsning for piezoelektriske dispenseringsrobotter, der danner et stabilt fald, så det er muligvis ikke muligt eller tilrådeligt at dispensere en meget høj koncentrationsopløsning. Fortynding af påfyldningsopløsningen er den nemmeste måde at opnå en stabil dråbedannelse på, men antigenstabilitet over de yderligere påfyldningscyklusser, der er nødvendige for at opnå den ønskede belastning, og den længere tid, der kræves for at fylde partikler, bør overvejes.
Begrænsninger
Denne metode kræver højt specialiseret udstyr til fremstilling af de indledende forme og et specialiseret påfyldningsinstrument til mikropartikelproduktion. Selvom behovet for en 3D-printer med en udskriftsopløsning, der er i stand til at generere de oprindelige masterforme, kan undergraves af en gebyr-for-service-tilgang, er tilgængeligheden til en piezoelektrisk dispenserrobot begrænsende. Indkøb af en piezoelektrisk dispenseringsrobot kræver en betydelig indledende forudgående investering, ofte i størrelsesordenen $ 80,000 til $ 200,000, afhængigt af mærke, gennemstrømning og kapacitet. Selv om flere andre påfyldningsmetoder er potentielle alternativer, er disse metoder ikke blevet valideret ved hjælp af RABV-antigen12.
Fremtidige applikationer
En væsentlig del af det indkapslede RABV-antigen forblev stabilt gennem forseglingsprocessen. I teorien, ved at inkorporere dette antigen i partikler sammensat af forskellige typer PLGA, der efterligner administrationstidslinjen for profylaksebehandling efter eksponering, kunne alle doser administreres i en enkelt injektion. Eliminering af behovet for gentagne hospitalsbesøg for at administrere yderligere doser vil forbedre patientens overholdelse, hvilket resulterer i bedre behandlingsresultater. Efter at have påvist evnen til at bevare ELISA-reaktiviteten af det meget komplekse inaktiverede rabiesvirus er det desuden sandsynligt, at andre antigener, herunder underenhedsvacciner, vil være kompatible med denne indkapslingsmetode. Brug af andre profylaktiske antigener med PULSERENDE mikropartikler kan redde millioner af liv i LMIC’er ved at øge vaccinationsraterne for undervaccinerede befolkninger. For at opnå dette skal vacciner imidlertid forblive stabile gennem ikke kun indkapsling, men også frigivelse, hvilket kan være udfordrende, da nyttelasten vil blive udsat for forhøjede temperaturer og et potentielt surt mikromiljø på grund af kropsvarme og PLGA-nedbrydningsprodukter18. Fremtidigt arbejde vil forfølge stabiliserende strategier for antigenet gennem frigivelse, hvilket vil åbne potentialet for en vaccinationsplatform med en enkelt injektion, der er bredt anvendelig til forebyggelse af mange smitsomme sygdomme.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Chiron Behring og Bharat Biotech International for at levere partikler til menneskeheden med RABV-antigenet. Vi vil også gerne takke Charles Rupprecht, VMD, MS, PhD., for hans uvurderlige vejledning og tekniske bidrag. Forfatterne vil gerne takke Dr. Rebecca Richards-Kortums generøsitet for at tillade brugen af hendes SciFLEXARRAYER S3 picoliter dispenseringsapparat og Dr. Chelsey Smiths instruktion om brug af enheden. Vi anerkender også University of Massachusetts Chan Medical School for at generere mikroskopibilleder af rabiesantigenet. Endelig takker vi Don Chickering og Erin Euliano for at have gennemgået dokumentet inden indsendelsen. Dette arbejde blev støttet af et tilskud (INV-004360) fra Bill and Melinda Gates Foundation.
0.22 µm PES filter | Cole-Parmer+B4B2:B63 | 04396-26 | |
0.25 mm Shims | McMaster Carr | 98090A935 | |
0.75 inch Binder Clips | Staples | 480114 | |
10 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309604 | |
10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11E | |
101.6 mm C-Clamp | Amazon | PT-SD-CP01A | Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens. |
19 G needle | EXCELINT | 26438 | |
25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11 | |
3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate | Millipore Sigma | M6514-25ML | |
5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Eppendorf | 22431081 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 352098 | |
50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11F | |
Acetone | Fisher | AC268310010 | |
Aluminum Block | McMaster Carr | 9057K175 | |
Aluminum Foil | VWR | 89079-069 | |
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa | Millipore Sigma | C82301 | |
Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100 | Fisherbrand | 13-678-11D | |
Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated | Fisherbrand | 14-388-100 | |
Carboxymethyl Cellulose | Tokyo Chemical Industries | C0045 | |
ClipTip 300, Filter, Racked | Fisherbrand | 13-678-11 | |
Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3206 | |
Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3207 | |
Describe | Nanoscribe | Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2. Software provided with the printer. |
|
Desiccator | Fisher Scientific | 10529901 | Or equivalent |
Double-Sided Tape | Staples | 649280 | |
DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium | Gibco | 14200075 | |
Ethanol | VWR | 89370-084 | |
F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL | Fisherbrand | 13-678-11E | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL | Fisherbrand | 13-678-11F | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL | Fisherbrand | 03-448-17 | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL | Fisherbrand | FB14955202 | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL | Fisherbrand | 13-374-10 | |
Fisherbrand Elite Pipette Kit | Fisherbrand | 05-408-137 | |
Fisherbrand Pipet Controller | Fisherbrand | FB14955202 | |
Glass Petri Dish, 90 mm | VWR | 470313-346 | |
Glass Slides | Globe Scientific | 1380-10 | |
Helicon Focus 8 | HeliconSoft | Software used to focus stack images | |
IP-Q Resin | Nanoscribe | Printer resin is compatable with the 10x lens and is used for printing large microstructures on the Nanoscribe Photonic Professional GT2 | |
Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple | Amazon | 5053485896236 | Or equivalent |
Microscope Slide Box | Millipore Sigma | Z374385-1EA | Or equivalent |
Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective | Nanoscribe | ||
NanoWrite | Nanoscribe | Software used to interface with nanoscrive 3D printer. Software provided with printer. |
|
Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
Parafilm M Wrapping Film, 4 in. | Fisherbrand | 13-374-10 | |
PDC 60 with Type 3 Coating | Scienion | P-2020 | |
PDMS Particle Molds | Rice University | n/a | N/A- Particles are 400 μm in diameter with a wall thickness of 100 μm, and a height of 500 μm, resulting in an inner diameter of 200 μm. The arrays are 14 x 22 particles spaced 600 μm apart from each other. 4- and 5-point stars are used as fiducials, positioned 600 μm to the right and left of the top right and top left particles on the array. |
Petri Dish | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
Plastic Cups | Fisher Scientific | S04170 | |
PLGA Film, 502H | Sigma | 502H: 719897-1G | |
Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate | Millipore Sigma | 484431 | |
Rabies Antigen | Chiron Behring and Bharat Biotech International | Material was acquired by entering into a materials transfer agreement with the company. | |
Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
Scalpel | VWR | 21899-530 and 76457-512 | |
SciFLEXARRAYER S3 with PCD 60 | Scienion | Or equivalent | |
Sealing Tape for 96-Well Plates | Thermo Scientific | 15036 | |
Silicon Wafer | University Wafer | 1025 | |
Spring Clamps | IRWIN | VGP58100 | |
Stainless Steel Block | McMaster Carr | 9083K12 | |
Streptavidin−Peroxidase Polymer, Ultrasensitive | Fisherbrand | 02-707-404 | |
Sylgard 184 | DOW | 2646340 | |
Teflon Sheet | McMaster Carr | 9266K12 | Used to make PLGA films. Must be cut into appropriately sized pieces. |
Teflon Sheet, 0.8 mm-thick | McMaster Carr | 9266K81 | |
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silane | Sigma | 448931-10G | |
Tweezers | Pixnor | ESD-16 | |
UltraPure Distilled Water | Fisher Scientific | 10977015 | |
UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker | UVP | 95-0174-01 | Or equivalent |
Vacuum Desiccator | Bel-Art | F420100000 | Note you will need two of these. One will be used exclusively to pre-treat samples with trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane to prevent contamination. |
Vacuum Oven Capable of Reaching 120 °C | VWR | 97027-664 | Or equivalent |
Vacuum, CRVpro4 | Welch | 3041-01 | Or equivalent |
Wooden Tongue Depressors | Electron Microscopy Sciences | 72320 |