Her demonstrerer vi brugen af cellebaseret elektrisk impedans (CEI) som en meget nem og ligetil metode til at studere Zika-virusinfektion og replikation i humane celler i realtid. Desuden er CEI-analysen nyttig til evaluering af antivirale forbindelser.
Cellebaseret elektrisk impedans (CEI) teknologi måler ændringer i impedans forårsaget af et voksende eller manipuleret klæbende cellemonolag på kulturpladebrønde indlejret med elektroder. Teknologien kan bruges til at overvåge konsekvenserne af Zika-virus (ZIKV) infektion og vedhængende cellereplikation i realtid, da denne virus er meget cytopatogen. Det er et ligetil assay, der ikke kræver brug af etiketter eller invasive metoder og har fordelen ved at levere realtidsdata. Kinetikken af ZIKV-infektion er stærkt afhængig af den anvendte cellelinje, virusstamme og mangfoldighed af infektion (MOI), som ikke let kan studeres med konventionelle endepunktsassays. Desuden kan CEI-analysen også anvendes til evaluering og karakterisering af antivirale forbindelser, som også kan have dynamiske hæmmende egenskaber i løbet af infektionen. Denne metodeartikel giver en detaljeret forklaring af den praktiske udførelse af CEI-analysen og dens potentielle anvendelser i ZIKV-forskning og antiviral forskning generelt.
Zikavirus (ZIKV) udbrud er forbundet med alvorlige sygdomskomplikationer, såsom mikrocefali og Guillain-Barre syndrom 1,2,3. Selvom fremtidige epidemier er plausible på grund af forskellige risikofaktorer såsom spredning af mygvektorfordeling og stigende urbanisering, har ingen vaccine eller antiviralt lægemiddel til dato gjort det til markedet endnu 3,4. Derfor bør traditionelle ZIKV-forskningsmetoder suppleres med nye værktøjer til at studere denne virus og dens potentielle antivirale forbindelser. Antiviral forskning er ofte baseret på fænotypiske assays, hvor endepunktet er tilstedeværelsen af en specifik parameter, såsom forekomsten af en virusinduceret cytopatisk effekt (CPE) eller produktion af et bestemt virusinduceret protein ved hjælp af et reportergen 5,6,7. Disse metoder har imidlertid slutpunktsaflæsninger, er arbejdskrævende og kan kræve kompleks analyse. Derfor tilbyder impedansbaserede metoder et attraktivt alternativ.
Cellebaseret elektrisk impedans (CEI) defineres som modstanden mod strømstrøm fra en elektrode til en anden, forårsaget af et klæbende cellelag podet på elektrodeholdige brønde. Den etablerede CEI-teknologi, der anvendes i denne metode, er Electric Cell-substrat Impedance Sensing (ECIS), oprindeligt udviklet af Giaever og Keese 8,9. Dette bruges i et bredt felt af biologiske forskningsområder, såsom kræftmetastaser, toksikologi og sårheling10,11,12. Dets princip er afhængig af et elektrisk felt, der genereres ved en kontinuerlig fejning af vekselstrømsspændinger (AC) over et frekvensområde13. Cellerne udsættes for disse ikke-invasive elektriske felter, og med forudbestemte intervaller måles impedansændringerne forårsaget af cellevækst eller ændringer i celleadhærens eller morfologi14. Desuden fører ændret cellelevedygtighed også til impedansændringer, hvilket gør teknologien til et nyttigt værktøj til overvågning af infektion med cytopatogene vira15,16,17. Da morfologiske ændringer af cellelaget vil blive detekteret i nanoskalaområdet, tilbyder teknologien et meget følsomt detektionsværktøj. CEI-analysen beskrevet i denne artikel er en nem, ikke-invasiv, realtids, etiketfri metode til at måle impedansændringerne i cellelaget over tid.
Selvom CEI ikke er blevet brugt til at evaluere forløbet af ZIKV-infektion eller dets potentielle antivirale midler, er dets anvendelse som et diagnostisk værktøj blevet undersøgt før18. I en nylig undersøgelse blev brugen af CEI-analysen til bestemmelse af den antivirale aktivitet af flere ZIKV-hæmmere i A549-celler valideret for første gang19. Denne metodeartikel beskriver dette CEI-assay mere detaljeret og udvider det til forskellige klæbende cellelinjer samt en række ZIKV-stammer ved forskellige infektionsmultipliciteter (MOI). Herved demonstreres den alsidige anvendelse af denne metode i flavivirus antiviral forskning. Metoden har den afgørende fordel ved celleovervågning i realtid, som gør det muligt at detektere vigtige infektionstider og den dynamiske hæmmende aktivitet af potentielle antivirale forbindelser. Samlet set udgør CEI-teknologien et kraftfuldt og værdifuldt værktøj til at supplere det nuværende udvalg af antivirale metoder.
Denne artikel beskriver brugen af CEI-analysen i ZIKV antiviral forskning. Assayet har fordelen ved realtidsovervågning og kan derfor bruges til at evaluere kinetikken af ZIKV-infektion og antiviral hæmning med selektive forbindelser. De data, der opnås med denne metode, muliggør en objektiv og visuel observation af den virusinducerede CPE og styrken af en potentiel antiviral forbindelse.
Da CEI er en meget følsom metode, skal der udvises stor omhu, når du udfører dette cellulære assay. Det er afgørende, at der udføres præcis pipettering for at undgå pipetteringsvariation så meget som muligt. Desuden skal andre faktorer, der kan påvirke eksperimentelle resultater, såsom cellenummer og brugt viral bestand, holdes konstante mellem eksperimentgentagelser. Dette er faktorer, der i høj grad påvirker kinetikken af cellevækst og infektion og derfor kan føre til variation i beregnede CIT50-værdier og/eller andre parametre.
Ved udførelse af CEI-analysen i nærvær af (potentielle) antivirale forbindelser er det vigtigt at afgøre, om de påvirker impedansen af cellerne i fravær af en virus. Teknikken er så følsom, at impedansændringer kan måles langt under forbindelsens cytotoksiske koncentrationer19.
Selvom kun ZIKV-data er vist i denne artikel, kan analysen let anvendes på andre cytopatogene (flavi)vira med kun minimal optimeringsindsats, såsom optimal bestemmelse af CEI-overvågningsfrekvens. Tilpasninger af CEI-analysen er blevet anvendt med forskellige humane og animalske vira, såsom chikungunya, influenza A og human og hesteherpesvirus25,26,27,28. Her anvendes den også som en simpel metode til kvantificering af virale titere eller til identifikation af antivirale forbindelser. Disse undersøgelser brugte celleanalyse i realtid, en alternativ CEI-metode.
Anvendelsen af CEI-teknologien er begrænset til klæbende celletyper, da analysens princip er afhængig af vedhængende cellers egenskaber for at sprede sig over de elektrodeindlejrede brønde. Brøndoverfladebelægninger såsom fibronectin kan bruges til at forbedre cellevedhæftning29. Metoden har nogle andre ulemper, den første relateret til dens omkostninger. Bortset fra investeringen i CEI-overvågningsenheden og tilhørende hard- og software er forbrugsstofferne også noget dyre. Da protokollen kræver overvågning af virusinfektion i flere dage, kan en 96-brøndplade om ugen evalueres. Sammen med de høje omkostninger begrænser dette brugen til indstillinger med lav til medium kapacitet.
På grund af disse gennemstrømningsproblemer er teknologien uegnet til antivirale screeningsindstillinger. Det er imidlertid meget tiltalende i indledende eksperimentelle faser, for eksempel ved evaluering af cellefølsomhed til undersøgelse af ZIKV-infektion i en bestemt sygdomsrelateret indstilling. Teknologien er også nyttig med transfekterede eller knockout-cellelinjer for let at observere ændringer i infektionskinetik, for eksempel i nærvær eller fravær af visse indgangsreceptorer. Dette er interessant, når man undersøger involvering af cellulære faktorer i ZIKV-infektion. I senere prækliniske faser, når en bestemt spidskandidat er blevet valgt, kan CEI-analysen anvendes til yderligere dybdegående karakterisering af en udvalgt forbindelse. CEI-biosensorer kan også ændres ved at immobilisere visse biogenkendelseselementer, såsom virusspecifikke antistoffer, til påvisning af vira18. Alt i alt fremhæver dette den alsidige brug af CEI i en virologiindstilling.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Clément Heymann og Gorrit Lootsma for korrekturlæsning af manuskriptet. Undersøgelsen blev støttet af interne bevillinger fra Laboratoriet for Virologi og Kemoterapi (Rega Institute, KU Leuven).
A549 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-185 | These cells are cultured in MEM Rega-3 supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.075% sodium bicarbonate. |
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Live/dead stain |
Cellstar polypropylene tubes, 15 mL | Greiner bio-one | 1,88,271 | |
Cellstar polypropylene tubes, 50 mL | Greiner bio-one | 2,27,261 | |
Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 41965-039 | Cell culture medium for U87 and HEL 299 cells |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
ECIS cultureware 96W20idf | Applied BioPhysics | 96W20idf PET | Assay plate for CEI device |
Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) Z array station | Applied BioPhysics | CEI device, including 96 well station, external control module and laptop with control, acquisition and display software. The necessary software is installed before shipment. NOTE: this device is currently out of production and has been replaced by the more advanced ECIS Z-Theta device | |
Falcon polystyrene tubes, 5 mL | Corning | 352054 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SV30160.03 | Cell culture medium additive for all used cells |
HEL 299 cells | ATCC | CCL-137 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
HEPES buffer, 1 M | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | Cell culture medium additive for U87 cells |
Labyrinthopeptin A1 | Kind gift from Prof. Dr. Roderich Süssmuth, Technische Universität Berlin, Germany | Antiviral compound used as an example in this protocol. It is dissolved in DMSO. | |
L-Glutamine, 200 mM | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Cell culture medium additive for A549 cells |
Luna cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | |
Luna-FL dual fluoresence cell counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell viability counter |
Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 19993013 | Cell culture medium for A549 cells |
Sodium Bicarbonate, 7.5% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25080-060 | Cell culture medium additive for A549 cells |
Tissue culture flask T75 | TPP | Y9076 | |
Trypsin-EDTA, 0.25% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | Dissociation reagent |
U87 cells | ATCC | HTB-14 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
Virkon Rely+On tablets | Lanxess | 115-0020 | Disinfectant sollution |
Zika virus (ZIKV) MR766 | ATCC | VR-84 | ZIKV prototype strain, isolated from sentinel Rhesus monkey in Uganda in 1968 |
ZIKV PRVABC59 | ATCC | VR-1843 | ZIKV strain isolated from patient in Puerto Rico in 2015 |