Isolering och identifiering av mesenkymala stamceller härrörande från fettvävnad från Sprague Dawley-råttor
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att isolera och identifiera fettvävnadshärledda mesenkymala stamceller (MSC) från Sprague Dawley-råttor.
Abstract
Vuxna mesenkymala celler har revolutionerat molekylär- och cellbiologin under de senaste decennierna. De kan differentieras till olika specialiserade celltyper, förutom deras stora kapacitet för självförnyelse, migration och spridning. Fettvävnad är en av de minst invasiva och mest tillgängliga källorna till mesenkymala celler. Det har också rapporterats ha högre avkastning jämfört med andra källor, samt överlägsna immunmodulerande egenskaper. Nyligen har olika förfaranden för att erhålla vuxna mesenkymala celler från olika vävnadskällor och djurarter publicerats. Efter att ha utvärderat kriterierna för vissa författare standardiserade vi en metod som är tillämplig på olika ändamål och lätt reproducerbar. En pool av stromal vaskulär fraktion (SVF) från perirenal och bitestikelvis fettvävnad gjorde det möjligt för oss att utveckla primära kulturer med optimal morfologi och funktionalitet. Cellerna observerades fästa vid plastytan i 24 timmar och uppvisade en fibroblastliknande morfologi, med förlängningar och en tendens att bilda kolonier. Flödescytometri (FC) och immunofluorescens (IF) tekniker användes för att bedöma uttrycket av membranmarkörerna CD105, CD9, CD63, CD31 och CD34. Förmågan hos fetthärledda stamceller (ASC) att differentiera till den adipogenic härstamningen bedömdes också med hjälp av en cocktail av faktorer (4 μM insulin, 0,5 mM 3-metyl-iso-butyl-xantin och 1 μM dexametason). Efter 48 timmar observerades en gradvis förlust av fibroblastoidmorfologi, och vid 12 dagar bekräftades närvaron av lipiddroppar positiva till oljeröd färgning. Sammanfattningsvis föreslås ett förfarande för att erhålla optimala och funktionella ASC-kulturer för tillämpning inom regenerativ medicin.
Introduction
Mesenkymala stamceller (MSC) har starkt påverkat regenerativ medicin på grund av deras höga kapacitet för självförnyelse, spridning, migration och differentiering i olika cellinjer 1,2. För närvarande fokuserar en hel del forskning på deras potential för behandling och diagnos av olika sjukdomar.
Det finns olika källor till mesenkymala celler: benmärg, skelettmuskel, fostervatten, hårsäckar, placenta och fettvävnad, bland andra. De erhålls från olika arter, inklusive människor, möss, råttor, hundar och hästar3. Benmärgshärledda MSC (BMSC) har använts i många år som en viktig källa till stamceller inom regenerativ medicin och som ett alternativ till användningen av embryonala stamceller4. Fett-härledda MSC, eller fett-härledda stamceller (ASC), är dock ett viktigt alternativ med stora fördelar på grund av deras enkla insamling och isolering, liksom utbytet av celler erhållna per gram fettvävnad 5,6. Det har rapporterats att skördegraden för ASC i allmänhet är högre än för BMSC7. Det föreslogs ursprungligen att den reparativa/regenerativa kapaciteten hos ASC berodde på deras förmåga att differentiera till andra cellinjer8. Forskning under de senaste åren har dock förstärkt den primära rollen för parakrina faktorer som frigörs av ASC i deras reparativa potential 9,10.
Fettvävnad (AT), förutom att vara en energireserv, interagerar med de endokrina, nervösa och kardiovaskulära systemen. Det är också involverat i postnatal tillväxt och utveckling, underhåll av vävnadshomeostas, vävnadsreparation och regenerering. AT består av adipocyter, vaskulära glattmuskelceller, endotelceller, fibroblaster, monocyter, makrofager, lymfocyter, preadipocyter och ASC. De senare har en viktig roll i regenerativ medicin på grund av deras låga immunogenicitet11,12. ASC kan erhållas genom enzymatisk nedbrytning och mekanisk bearbetning eller genom fettvävnadsexplantat. Primära kulturer av ASC är lätta att underhålla, växa och expandera. Fenotypisk karakterisering av ASC är avgörande för att verifiera cellernas identitet genom att bedöma uttrycket av specifika membranmarkörer med hjälp av metoder som immunofluorescens och flödescytometri13. International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) och International Society for Cellular Therapy (ISCT) har definierat att ASC uttrycker CD73, CD90 och CD105, samtidigt som de saknar uttryck av CD11b, CD14, CD19, CD45 och HLA-DR14. Dessa markörer, både positiva och negativa, anses därför vara tillförlitliga för karakterisering av ASC.
Detta projekt fokuserade på att beskriva ett förfarande för isolering och identifiering av vuxna mesenkymala celler extraherade från råttors AT, eftersom denna källa till celler inte utgör etiska utmaningar, till skillnad från embryonala stamceller. Detta stärker förfarandet som ett genomförbart alternativ på grund av enkel åtkomst och minimalt invasiv metod jämfört med benmärgshärledda stamceller.
Mesenkymala celler från denna vävnadskälla har en viktig roll i regenerativ medicin på grund av deras immunmodulerande förmåga och låga immunavstötning. Därför är den aktuella studien en grundläggande del av framtida forskning om deras sekretom och deras tillämpning som regenerativ terapi vid olika sjukdomar, inklusive metaboliska sjukdomar som diabetes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under de senaste fyra decennierna sedan upptäckten av MSC har flera grupper av forskare beskrivit förfaranden för att erhålla MSC från olika vävnader och arter. En av fördelarna med att använda råttor som djurmodell är deras enkla underhåll och snabba utveckling, liksom det är lätt att få MSC från fettvävnad. Olika vävnadskällor har beskrivits för att erhålla ASC, såsom visceralt, perirenalt, epididymalt och subkutant fett 12,13,14,15,16.<sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är tacksamma för det mexikanska institutet för social trygghet (IMSS) och Children’s Hospital of Mexico, Federico Gomez (HIMFG) och Bioterio-personalen vid IMSS Research Coordination, för det stöd som ges för att genomföra detta projekt. Vi tackar National Council of Science and Technology för AOC-stipendiet (815290) och Antonio Duarte Reyes för det tekniska stödet i det audiovisuella materialet.
Materials
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
Referências
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
- González, M. . Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , (2014).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).
- Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
- Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
- Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
- Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
- Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).
- Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).
- Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
- Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
- Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
- Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
- Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
- Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
- He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).
