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Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley

DOI:

10.3791/65172

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April 7th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Medical Research Unit in Biochemistry, Specialties Hospital, National Medical Center SXXI, Instituto Mexicano de Seguro Social, 3Department of Agricultural and Animal Production, Division of Biological and Health Science, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, 4Molecular Biology Research Laboratory, Center for Congenital Malformations, Children Hospital of Mexico Federico Gomez (HIMFG)

In This Article

Summary

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Este protocolo descreve uma metodologia para isolar e identificar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley.

Abstract

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As células mesenquimais adultas revolucionaram a biologia molecular e celular nas últimas décadas. Podem diferenciar-se em diferentes tipos celulares especializados, além de sua grande capacidade de auto-renovação, migração e proliferação. O tecido adiposo é uma das fontes menos invasivas e mais acessíveis de células mesenquimais. Também tem sido relatado para ter rendimentos mais elevados em comparação com outras fontes, bem como propriedades imunomoduladoras superiores. Recentemente, diferentes procedimentos para obtenção de células mesenquimais adultas de diferentes fontes teciduais e espécies animais têm sido publicados. Após avaliação dos critérios de alguns autores, padronizamos uma metodologia aplicável a diferentes propósitos e facilmente reprodutível. Um pool de fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo perirrenal e epididimal nos permitiu desenvolver culturas primárias com morfologia e funcionalidade ideais. As células foram observadas aderidas à superfície plástica por 24 h e exibiram morfologia semelhante a fibroblastos, com prolongamentos e tendência a formar colônias. As técnicas de citometria de fluxo (CF) e imunofluorescência (IF) foram utilizadas para avaliar a expressão dos marcadores de membrana CD105, CD9, CD63, CD31 e CD34. A capacidade das células-tronco derivadas do tecido adiposo (CTAs) de se diferenciar na linhagem adipogênica também foi avaliada usando um coquetel de fatores (4 μM de insulina, 0,5 mM de 3-metil-iso-butil-xantina e 1 μM de dexametasona). Após 48 h, observou-se perda gradual da morfologia fibroblastóide e, aos 12 dias, confirmou-se a presença de gotículas lipídicas positivas para coloração vermelho oleoso. Em resumo, propõe-se um procedimento para obtenção de culturas de ASC ótimas e funcionais para aplicação em medicina regenerativa.

Introduction

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As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm forte impacto na medicina regenerativa devido à sua alta capacidade de auto-renovação, proliferação, migração e diferenciação em diferentes linhagens celulares 1,2. Atualmente, uma grande quantidade de pesquisas está se concentrando em seu potencial para o tratamento e diagnóstico de várias doenças.

Existem diferentes fontes de células mesenquimais: medula óssea, músculo esquelético, líquido amniótico, folículos pilosos, placenta, tecido adiposo, entre outros. São obtidos de diferentes espécies, incluindo humanos, camundongos, ratos, cães e ....

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Protocol

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Todos os procedimentos experimentais foram realizados seguindo as Diretrizes Mexicanas para Cuidados com Animais, baseadas nas recomendações da Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, México). O protocolo foi revisado, aprovado e registrado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Saúde do Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).

1. Remoção de tecido adiposo de ratos por ressecção cirúrgica

  1. Preparar dois tubos cônicos com 20 mL de solução antimicótica salina-antimicótica tamponada com fosfato 1x (PBS-AA) estéril (1x PBS....

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Results

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O tecido adiposo foi obtido de ratos adultos da raça Sprague Dawley, com idade entre 3 e 4 meses de idade e peso corporal de 401 ± 41 g (média geométrica ± DP). O valor médio de 3,8 g de tecido adiposo epididimal e perirrenal correspondeu à análise de 15 extrações experimentais. Após 24 h de cultivo, as populações celulares permaneceram aderidas à superfície plástica e exibiram morfologia heterogênea. A primeira passagem foi realizada aos 8 ± 2 dias, com rendimento de 1,4 ± 0,6 x10,6 células em um total de oit.......

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Discussion

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Nas últimas quatro décadas, desde a descoberta das CTMs, vários grupos de pesquisadores descreveram procedimentos para a obtenção de CTMs de diferentes tecidos e espécies. Uma das vantagens do uso de ratos como modelo animal é a sua fácil manutenção e rápido desenvolvimento, bem como a facilidade de obtenção de CTMs a partir do tecido adiposo. Diferentes fontes teciduais têm sido descritas para a obtenção de CTAs, como gordura visceral, perirrenal, epididimal e subcutânea12,13,14,15,16........

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Disclosures

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgements

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Os autores agradecem ao Instituto Mexicano de Seguridade Social (IMSS) e ao Hospital Infantil do México, Federico Gomez (HIMFG) e à equipe de Biotério da Coordenação de Pesquisa do IMSS, pelo apoio dado para a realização deste projeto. Agradecemos ao Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia pela bolsa AOC (815290) e a Antonio Duarte Reyes pelo apoio técnico no material audiovisual.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anfotericina BHyCloneSV30078.01
Balança analíticaSartoriusAX224
Anticorpo anti-CD9 (C-4)Santa CruzSc-13118
Anticorpo anti-CD34 (C-18)Santa CruzSc-7045
Anticorpo anti-C63Santa CruzSc-5275
Anticorpo anti-Endoglina/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 Santa CruzSc-18838A594
Anticorpo anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680Santa CruzSc-18916AF680
Anticorpo Cabra anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 NovusNB 120-6939
Anticorpo Burro anti-cabra IgG (H+L) DyLight 550 InvitrogenSA5-10087
Anticorpo anti-rato IgG FITC conjugado cabra F (ab&agudo;)Sistemas RD.Nº F103B
Filtro Superior de Garrafa EstérilFrascosde Cultura de Células
CORNING BIOFIL170718-312B
Contador de Células Hemacitômetro de Linha Brilhante com lâminas de câmara de contagem de célulasSIGMA Aldrich
Poços de células: 6 poços
Tubos cônicos de centrífugaHeTTICHROTANA460R
Tubos eppendorf CentrifugeFischer ScientificM0018242_44797
Collagen IV WorthingtonLS004186
CryovialSPL Life Science43112
Tubos de culturaGreiner Bio-One 191180
CytExpert 2.0Beckman CoulterVersão
Citômetro CytoFlex LXBeckman CoulterFLOW-2463VID03.17
DMEMGIBCO31600-034
DMSOSIGMA Aldrich 67-68-5
DraQ7 CoranteThermo Sc. D15106
EDTASIGMA Aldrich60-00-4
Eosin amareladoHycel300
Etanol 96%Baker64-17-5
Tubos Falcon 15 mLGreiner Bio-One 188271
Tubos Falcon 50 mLGreiner Bio-One 227261
Soro Fetal Bovino CORNING35-010-CV
GelatinaSIGMA Aldrich128111163
GentamicinaGIBCO15750045
Glicerina-Alta PurezaHerschi Trading 56-81-5
HematoxilinaAMRESCO 0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubadora Thermo Sc.
Ketamin Pet (Cetamina clorhidrate)ArandaSV057430
L-Glutamina GIBCO / Thermo Sc. 25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5Versão
Gabinete de Segurança Biológica Classe IINuAire12082100801
Microscópio epifluorescente Zeiss Axiovert 100M21.0028.001
Microscópio invertido Olympus CK40CK40-G100
Aminoácidos não essenciais 100XGIBCO11140050
Microtubos 2 mL Sarstedt 72695400
Microtubos 1,5 mLSarstedt 72706400
Micropipetas 0,2-2 μ LFinnpipetteE97743
Micropipetas 2-20 μ LFinnpipetteF54167
Micropipetas 20-200 μ LFinnpipetteG32419
Micropipetas 100-1000 μ LFinnpipetteFJ39895
Tanque de nitrogênio líquidoTaylor-Wharton681-021-06
ParaformaldeídoSIGMA AldrichSLBC3029V
Penicilina / Estreptomicina GIBCO / Thermo Sc.
Placa de Petri Cultura de célulasCORNING Inc480167
Pontas de pipetaAxygen Scientific301-03-201
Pisabental (pentobarbital sódico)PISA AgropecuáriaQ-7833-215
Cloreto de potássio J.T.Baker7447-40-7
Fosfato de potássio dibásicoJ.T Baker2139900
S1 Enchimentos de pipetaThermo Sc9531
Pipeta sorológica 5 mLPYREXL010005
Pipeta sorológica 10 mLPYREXL010010
Bicarbonato de sódioJ.T Baker144-55-8
Cloreto de sódio J.T.Baker15368426
Fosfato de sódio dibásico anidroJ.T Baker7558-79-4
Piruvato de sódioGIBCO BRL11840-048
Seringa Filtro EstérilCORNING431222
EspectrofotômetroPerkinElmer Lambda 25L6020060
Agitador de placas tituladorasLAB-LINE1250
Pipetas de transferênciaSamco/Thermo Sc728NL
Trypan Blue manchaGIBCO1198566
Tripsina Do Pâncreas SuínoSIGMA Aldrich102H0234
Tween 20SIGMA Aldrich9005-64-5
Reagente de Bloqueio Universal 10xBioGenexHK085-GP
Xilapet 2% (cloridrato de xilazina)Pet' s PharmaQ-7972-025
e Tecidos de 10718003 Z359629 com tampa CORNING 25810 gratuita50116047gratuita15140122

References

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  1. Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
  2. Greenwood, M. R., Hirsch, J.

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