Microinjection ciblée et électroporation d’organoïdes cérébraux de primates pour la modification génétique
Summary
L’électroporation des organoïdes cérébraux des primates fournit une approche précise et efficace pour introduire des modifications génétiques transitoires dans différents types de progéniteurs et de neurones dans un système modèle proche du développement du néocortex (patho)physiologique des primates. Cela permet l’étude des processus neurodéveloppementaux et évolutifs et peut également être appliqué à la modélisation des maladies.
Abstract
Le cortex cérébral est la structure cérébrale la plus externe et est responsable du traitement des entrées sensorielles et des sorties motrices; Il est considéré comme le siège des capacités cognitives d’ordre supérieur chez les mammifères, en particulier les primates. L’étude des fonctions des gènes dans le cerveau des primates est difficile pour des raisons techniques et éthiques, mais la mise en place de la technologie organoïde du cerveau a permis l’étude du développement du cerveau dans des modèles traditionnels de primates (par exemple, le macaque rhésus et le ouistiti commun), ainsi que chez des espèces de primates auparavant inaccessibles expérimentalement (par exemple, les grands singes), dans un système éthiquement justifiable et moins exigeant techniquement. De plus, les organoïdes cérébraux humains permettent l’investigation avancée des troubles neurodéveloppementaux et neurologiques.
Comme les organoïdes cérébraux récapitulent de nombreux processus de développement du cerveau, ils représentent également un outil puissant pour identifier les différences et comparer fonctionnellement les déterminants génétiques sous-jacents au développement du cerveau de diverses espèces dans un contexte évolutif. Un grand avantage de l’utilisation d’organoïdes est la possibilité d’introduire des modifications génétiques, ce qui permet de tester les fonctions des gènes. Cependant, l’introduction de telles modifications est laborieuse et coûteuse. Cet article décrit une approche rapide et rentable pour modifier génétiquement les populations cellulaires dans les structures ventriculaires des organoïdes cérébraux des primates, un sous-type d’organoïdes cérébraux. Cette méthode combine un protocole modifié pour la génération fiable d’organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) humaines, chimpanzés, macaques rhésus et communes dérivées de ouistitis. Cela fournit un outil efficace pour l’étude des processus neurodéveloppementaux et évolutifs qui peut également être appliqué à la modélisation de la maladie.
Introduction
Étudier le développement (physio)physiologique et l’évolution du cortex cérébral est une tâche formidable qui est entravée par le manque de systèmes modèles appropriés. Auparavant, ces études se limitaient à des modèles de culture cellulaire bidimensionnelle (tels que les cultures de cellules neuronales primaires ou neuronales) et à des modèles animaux distants de l’évolution (tels que les rongeurs)1,2. Bien que ces modèles soient utiles pour répondre à certaines questions, ils sont limités dans la modélisation de la complexité, de la composition du type cellulaire, de l’architecture cellulaire et des modèles d’expression génique du néocortex humain en développement dans des états sains et malades. Ces limitations conduisent, par exemple, à la faible transposabilité des modèles murins de maladies humaines à la situation humaine, comme décrit pour certains cas de microcéphalie (par exemple, Zhang et al.3). Récemment, les primates transgéniques non humains, qui sont un modèle évolutif, fonctionnel et morphologiquement plus proche du développement du néocortex humain, ont attiré l’attention 4,5,6,7,8 alors qu’ils surmontent de nombreuses limitations des modèles basés sur la culture cellulaire et les rongeurs. Cependant, l’utilisation de primates non humains dans la recherche est non seulement très coûteuse et prend beaucoup de temps, mais soulève également des préoccupations éthiques. Plus récemment, le développement de la technologie des organoïdes cérébraux 9,10 est apparu comme une alternative prometteuse qui résout bon nombre des limitations des modèles précédents 11,12,13,14,15,16.
Les organoïdes cérébraux sont des structures multicellulaires tridimensionnelles (3D) qui émulent les principales caractéristiques de la cytoarchitecture et de la composition de type cellulaire d’une ou de plusieurs régions du cerveau pendant une fenêtre temporelle de développement définie 11,12,13,14,17. Ces structures 3D sont générées soit à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) ou, si elles sont disponibles pour l’espèce d’intérêt, à partir de cellules souches embryonnaires (CSE). En général, deux types d’organoïdes cérébraux peuvent être distingués en fonction de la méthodologie utilisée: les organoïdes cérébraux non guidés et régionalisés (guidés)18. Lors de la génération de ce dernier type d’organoïdes, de petites molécules ou facteurs sont fournis qui guident la différenciation des cellules souches pluripotentes en organoïdes d’une région particulière du cerveau (par exemple, les organoïdes du cerveau antérieur)18. En revanche, chez les organoïdes non guidés, la différenciation n’est pas guidée par l’addition de petites molécules, mais repose exclusivement sur la différenciation spontanée des CSPi/ESC. Les organoïdes cérébraux qui en résultent sont constitués de types de cellules représentant différentes régions du cerveau (p. ex., les organoïdes cérébraux)18. Les organoïdes cérébraux combinent de nombreuses caractéristiques clés du développement du cerveau avec une génération relativement rentable et rapide à partir de toute espèce d’intérêt pour laquelle des CSPi ou des CSE sont disponibles11,12,13,14. Cela fait des organoïdes cérébraux un excellent modèle pour de nombreux types d’études neurobiologiques, allant des questions évolutives et développementales à la modélisation des maladies et aux tests de médicaments15,16. Cependant, la résolution de ces questions à l’aide d’organoïdes cérébraux dépend fortement de la disponibilité de différentes méthodes de modification génétique.
Un aspect clé de l’étude du développement (physio)physiologique du néocortex et de son évolution est l’analyse fonctionnelle des gènes et des variantes génétiques. Ceci est généralement réalisé par expression (ectopique) et / ou par knock-down (KD) ou knock-out (KO) de ces gènes. Ces modifications génétiques peuvent être classées en modifications génétiques stables et transitoires, ainsi qu’en modifications limitées temporellement et spatialement ou non restreintes. La modification génétique stable est définie par l’introduction d’une altération génétique dans le génome de l’hôte qui est transmise à toutes les générations cellulaires ultérieures. Selon le moment de la modification génétique, elle peut affecter toutes les cellules d’un organoïde ou peut être limitée à certaines populations cellulaires. Le plus souvent, une modification génétique stable est obtenue dans les organoïdes cérébraux au niveau iPSC/ESC en appliquant des lentivirus, des systèmes de type transposon et la technologie CRISPR/Cas9 (examinée par, par exemple, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19, et Teriyapirom et al.20). Cela a l’avantage que toutes les cellules de l’organoïde cérébral portent la modification génétique et qu’elle n’est pas restreinte dans le temps ou dans l’espace. Cependant, la génération et la caractérisation de ces lignées stables d’iPSC/ESC prennent beaucoup de temps, prenant souvent plusieurs mois avant que les premiers organoïdes cérébraux modifiés puissent être analysés (examinés par exemple par Fischer et al.17, Kyrousi et al.19, ou Teriyapirom et al.20).
En revanche, la modification génétique transitoire est définie par la livraison d’une cargaison génétique (p. ex., un plasmide d’expression génique) qui ne s’intègre pas dans le génome de l’hôte. Bien que cette modification puisse, en principe, être transmise aux générations cellulaires suivantes, la cargaison génétique délivrée sera progressivement diluée à chaque division cellulaire. Par conséquent, ce type de modification génétique est généralement limité dans le temps et dans l’espace. La modification génétique transitoire peut être effectuée dans les organoïdes cérébraux par des virus adéno-associés ou par électroporation (examinés par, par exemple, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 et Teriyapirom et al.20), ces derniers étant décrits en détail dans cet article. Contrairement à la modification génétique stable, cette approche est très rapide et rentable. En effet, l’électroporation peut être effectuée en quelques minutes et, selon la ou les populations de cellules cibles, les organoïdes électroporés sont prêts à être analysés en quelques jours (examinés par, par exemple, Fischer et al.17 et Kyrousi et al.19). Cependant, les changements morphologiques bruts de l’organoïde cérébral, tels que les différences de taille, ne peuvent pas être détectés à l’aide de cette méthode, car ce type de modification génétique est limité dans le temps et dans l’espace. Cette restriction peut également être un avantage, par exemple, dans le cas de l’étude de populations cellulaires individuelles au sein de l’organoïde ou des effets sur les organoïdes cérébraux à des moments précis du développement (examinés par, par exemple, Fischer et al.17 et Kyrousi et al.19).
Une approche classique pour étudier la fonction des gènes au cours du développement et de l’évolution du cerveau est l’électroporation in utero. L’électroporation in utero est une technique bien connue et utile pour l’administration de constructions d’expression génique dans les cerveaux des rongeurs 21,22,23 et des furets24,25. Tout d’abord, une solution contenant la ou les constructions d’expression d’intérêt est microinjectée à travers la paroi utérine dans un certain ventricule du cerveau embryonnaire, en fonction de la région à cibler. Dans la deuxième étape, des impulsions électriques sont appliquées pour transfecter les cellules qui tapissent directement le ventricule ciblé. Cette approche ne se limite pas seulement à l’expression ectopique ou à la surexpression des gènes, car elle peut également être appliquée dans les études KD ou KO par micro-injection d’épingle à cheveux courte (shRNA) ou de CRISPR/Cas9 (sous forme de plasmides d’expression ou de ribonucléoprotéines [RNP]), respectivement26,27. Cependant, l’électroporation in utero d’embryons de souris, de rats et de furets présente les mêmes limites que celles décrites ci-dessus pour ces modèles animaux.
Idéalement, on aimerait effectuer une électroporation in utero directement chez les primates. Bien que cela soit, en principe, techniquement possible, l’électroporation in utero n’est pas effectuée chez les primates en raison de préoccupations éthiques, de coûts élevés d’entretien des animaux et de la petite taille des portées. Pour certains primates, comme les grands singes (y compris les humains), ce n’est pas possible du tout. Cependant, ces primates ont le plus grand potentiel pour l’étude du développement du néocortex humain (physionomique) physiologique et de son évolution. Une solution à ce dilemme est d’appliquer la technique d’électroporation aux organoïdes cérébraux des primates28.
Cet article présente un protocole pour l’électroporation d’un sous-type d’organoïdes cérébraux de primates, les organoïdes cérébraux des primates. Cette approche permet la modification génétique rapide et rentable des populations cellulaires dans les structures ventriculaires des organoïdes. Plus précisément, nous décrivons un protocole unifié pour la génération d’organoïdes cérébraux de primates à partir d’iPSC humains (Homo sapiens), de chimpanzés (Pan troglodytes), de macaques rhésus (Macaca mulatta) et de ouistiti commun (Callithrix jacchus). De plus, nous décrivons en détail la technique de micro-injection et d’électroporation et fournissons des critères « go » et « no-go » pour effectuer l’électroporation organoïde cérébrale des primates. Cette approche est un outil efficace pour étudier le développement (physionomophysiologique) du néocortex et son évolution dans un modèle particulièrement proche de la situation humaine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les procédures décrites ici représentent un protocole unifié pour la génération d’organoïdes cérébraux à partir de différentes espèces de primates avec une approche d’électroporation ciblée. Cela permet l’expression ectopique d’un GOI dans un système modèle qui émule le développement du néocortex (patho)physiologique des primates (y compris humains). Ce protocole unifié pour la génération d’organoïdes cérébraux de primates utilise les mêmes matériaux (p. ex., les mêmes milieux) et le…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous nous excusons auprès de tous les chercheurs dont les travaux n’ont pas pu être cités en raison du manque d’espace. Nous remercions Ulrich Bleyer des services techniques de DPZ et Hartmut Wolf de l’atelier de MPI-CBG pour la construction des chambres d’électrodes de la boîte de Petri ; Stoyan Petkov et Rüdiger Behr pour avoir fourni des CSPi humaines (iLonza2.2), rhésus (iRh33.1) et ouistitis (cj_160419_5); Sabrina Heide pour la cryosectionnement et la coloration par immunofluorescence; et Neringa Liutikaite et César Mateo Bastidas Betancourt pour la lecture critique du manuscrit. Les travaux dans le laboratoire de W.B.H. ont été soutenus par une subvention ERA-NET NEURON (MicroKin). Les travaux dans le laboratoire de M.H. ont été soutenus par une bourse de démarrage du CER (101039421).
Materials
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
Referências
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