आनुवंशिक संशोधन के लिए प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स का लक्षित माइक्रोइंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन
Summary
प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स का इलेक्ट्रोपोरेशन प्राइमेट (पैथो) फिजियोलॉजिकल नियोकॉर्टेक्स विकास के करीब एक मॉडल सिस्टम में विभिन्न पूर्वज प्रकारों और न्यूरॉन्स में क्षणिक आनुवंशिक संशोधन (ओं) को पेश करने के लिए एक सटीक और कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है। यह न्यूरोडेवलपमेंटल और विकासवादी प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देता है और रोग मॉडलिंग के लिए भी लागू किया जा सकता है।
Abstract
सेरेब्रल कॉर्टेक्स सबसे बाहरी मस्तिष्क संरचना है और संवेदी इनपुट और मोटर आउटपुट के प्रसंस्करण के लिए जिम्मेदार है; इसे स्तनधारियों, विशेष रूप से, प्राइमेट्स में उच्च-क्रम संज्ञानात्मक क्षमताओं की सीट के रूप में देखा जाता है। प्राइमेट दिमाग में जीन कार्यों का अध्ययन तकनीकी और नैतिक कारणों से चुनौतीपूर्ण है, लेकिन मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड तकनीक की स्थापना ने पारंपरिक प्राइमेट मॉडल (जैसे, रीसस मकाक और आम मार्मोसेट) में मस्तिष्क के विकास के अध्ययन को सक्षम किया है, साथ ही साथ पहले प्रयोगात्मक रूप से दुर्गम प्राइमेट प्रजातियों (जैसे, महान वानर) में, नैतिक रूप से उचित और कम तकनीकी रूप से मांग वाली प्रणाली में। इसके अलावा, मानव मस्तिष्क ऑर्गेनोइड ्स न्यूरोडेवलपमेंटल और न्यूरोलॉजिकल विकारों की उन्नत जांच की अनुमति देते हैं।
जैसा कि मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स मस्तिष्क के विकास की कई प्रक्रियाओं को पुन: उत्पन्न करते हैं, वे एक विकासवादी संदर्भ में विभिन्न प्रजातियों के मस्तिष्क के विकास में अंतर्निहित आनुवंशिक निर्धारकों में अंतर की पहचान करने और कार्यात्मक रूप से तुलना करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का भी प्रतिनिधित्व करते हैं। ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करने का एक बड़ा लाभ आनुवंशिक संशोधनों को पेश करने की संभावना है, जो जीन कार्यों के परीक्षण की अनुमति देता है। हालांकि, इस तरह के संशोधनों की शुरूआत श्रमसाध्य और महंगी है। यह पेपर प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं के भीतर आनुवंशिक रूप से सेल आबादी को संशोधित करने के लिए एक तेज और लागत कुशल दृष्टिकोण का वर्णन करता है, जो मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का एक उपप्रकार है। यह विधि मानव-, चिंपांज़ी-, रीसस मकाक-और सामान्य मार्मोसेट-व्युत्पन्न प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (आईपीएससी) से सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की विश्वसनीय पीढ़ी के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल को एक माइक्रोइंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन दृष्टिकोण के साथ जोड़ती है। यह न्यूरोडेवलपमेंटल और विकासवादी प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक प्रभावी उपकरण प्रदान करता है जिसे रोग मॉडलिंग के लिए भी लागू किया जा सकता है।
Introduction
सेरेब्रल कॉर्टेक्स के (पैथो) शारीरिक विकास और विकास की जांच करना एक दुर्जेय कार्य है जो उपयुक्त मॉडल सिस्टम की कमी से बाधित है। पहले, इस तरह के अध्ययन दो-आयामी सेल कल्चर मॉडल (जैसे प्राथमिक तंत्रिका पूर्वज या न्यूरोनल सेल संस्कृतियों) और विकासवादी रूप से दूर के पशु मॉडल (जैसे कृन्तक) 1,2 तक ही सीमित थे। हालांकि ये मॉडल कुछ प्रश्नों को संबोधित करने के लिए उपयोगी हैं, वे स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्यों में विकासशील मानव नियोकॉर्टेक्स की जटिलता, सेल प्रकार संरचना, सेलुलर वास्तुकला और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को मॉडलिंग में सीमित हैं। ये सीमाएं, उदाहरण के लिए, मानव स्थितियों के लिए मानव रोगों के माउस मॉडल की खराब हस्तांतरणीयता की ओर ले जाती हैं, जैसा कि माइक्रोसेफली के कुछ मामलों के लिए वर्णित है (जैसे, झांग एट अल.3)। हाल ही में, ट्रांसजेनिक गैर-मानव प्राइमेट्स, जो मानव नियोकॉर्टेक्स विकास के विकासात्मक, कार्यात्मक और रूपात्मक रूप से करीबी मॉडल हैं, 4,5,6,7,8 पर ध्यान केंद्रित किए गए हैं क्योंकि वे सेल संस्कृति- और कृंतक-आधारित मॉडल की कई सीमाओं को पार करते हैं। हालांकि, अनुसंधान में गैर-मानव प्राइमेट्स का उपयोग न केवल अत्यधिक महंगा और समय लेने वाला है, बल्कि नैतिक चिंताओं को भी बढ़ाता है। हाल ही में, मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड प्रौद्योगिकी 9,10 का विकास एक आशाजनक विकल्प के रूप में उभरा है जो पिछले मॉडल 11,12,13,14,15,16 की कई सीमाओं को हल करता है।
मस्तिष्क ऑर्गेनोइड ्स त्रि-आयामी (3 डी), बहुकोशिकीय संरचनाएं हैं जो परिभाषित विकास समय विंडो 11,12,13,14,17 के लिए एक या कई मस्तिष्क क्षेत्रों की साइटोआर्किटेक्चर और सेल-प्रकार संरचना की मुख्य विशेषताओं का अनुकरण करती हैं। ये 3 डी संरचनाएं या तो प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से उत्पन्न होती हैं या, यदि रुचि की प्रजातियों के लिए उपलब्ध हैं, तो भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) से। सामान्य तौर पर, दो प्रकार के मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स को उपयोग की जाने वाली पद्धति के आधार पर अलग किया जा सकता है: अनिर्देशित और क्षेत्रीय (निर्देशित) मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स18। बाद के प्रकार के ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने में, छोटे अणु या कारक प्रदान किए जाते हैं जो प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को एक विशेष मस्तिष्क क्षेत्र (जैसे, फोरब्रेन ऑर्गेनोइड्स) के ऑर्गेनोइड्स में मार्गदर्शन करते हैं। इसके विपरीत, अनिर्देशित ऑर्गेनोइड्स में, भेदभाव छोटे अणुओं के अतिरिक्त द्वारा निर्देशित नहीं होता है, बल्कि विशेष रूप से आईपीएससी / ईएससी के सहज भेदभाव पर निर्भर करता है। परिणामी मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स में विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों (जैसे, सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स) का प्रतिनिधित्व करने वाले सेल प्रकार होते हैं। ब्रेन ऑर्गेनोइड्स मस्तिष्क के विकास की कई प्रमुख विशेषताओं को किसी भी प्रजाति से अपेक्षाकृत लागत और समय-कुशल पीढ़ी के साथ जोड़ते हैं, जिसके लिए आईपीएससी या ईएससी उपलब्ध हैं11,12,13,14। यह मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स को कई प्रकार के न्यूरोबायोलॉजिकल अध्ययनों के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाता है, जिसमें विकासवादी और विकासात्मक प्रश्नों से लेकर रोग मॉडलिंग और दवा परीक्षण15,16 शामिल हैं। हालांकि, मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके ऐसे सवालों को संबोधित करना आनुवंशिक संशोधन के लिए विभिन्न तरीकों की उपलब्धता पर निर्भर करता है।
नियोकॉर्टेक्स (पैथो) शारीरिक विकास और इसके विकास का अध्ययन करने का एक महत्वपूर्ण पहलू जीन और जीन वेरिएंट का कार्यात्मक विश्लेषण है। यह आमतौर पर (अटोपिक) अभिव्यक्ति और / या उन जीनों के नॉक-डाउन (केडी) या नॉक-आउट (केओ) द्वारा प्राप्त किया जाता है। इस तरह के आनुवंशिक संशोधनों को स्थिर और क्षणिक आनुवंशिक संशोधन में वर्गीकृत किया जा सकता है, साथ ही संशोधनों को अस्थायी और स्थानिक रूप से प्रतिबंधित किया जा सकता है या प्रतिबंधित नहीं किया जा सकता है। स्थिर आनुवंशिक संशोधन को मेजबान जीनोम में आनुवंशिक परिवर्तन की शुरूआत से परिभाषित किया जाता है जो बाद की सभी कोशिका पीढ़ियों को पारित किया जाता है। आनुवंशिक संशोधन के समय बिंदु के आधार पर, यह एक ऑर्गनॉइड की सभी कोशिकाओं को प्रभावित कर सकता है या कुछ सेल आबादी तक सीमित हो सकता है। सबसे अधिक बार, आईपीएससी / ईएससी स्तर पर मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स में स्थिर आनुवंशिक संशोधन लेंटिवायरस, ट्रांसपोसन जैसी प्रणालियों और सीआरआईएसपीआर / कैस 9 तकनीक (उदाहरण के लिए, फिशर एट अल.17, किरोसी एट अल.19, और टेरियापिरोम एट अल.20 द्वारा समीक्षा) को लागू करके प्राप्त किया जाता है। इसका लाभ यह है कि मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड की सभी कोशिकाएं आनुवंशिक संशोधन करती हैं और यह अस्थायी या स्थानिक रूप से प्रतिबंधित नहीं है। हालांकि, इन स्थिर आईपीएससी / ईएससी लाइनों की पीढ़ी और लक्षण वर्णन बहुत समय लेने वाला है, अक्सर पहले संशोधित मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स का विश्लेषण करने तक कई महीने लगते हैं (उदाहरण के लिए, फिशर एट अल.17, किरोसी एट अल.19, या टेरियापिरोम एट अल.20 द्वारा समीक्षा की गई)।
इसके विपरीत, क्षणिक आनुवंशिक संशोधन को आनुवंशिक कार्गो (जैसे, एक जीन अभिव्यक्ति प्लास्मिड) के वितरण द्वारा परिभाषित किया जाता है जो मेजबान जीनोम में एकीकृत नहीं होता है। जबकि यह संशोधन, सिद्धांत रूप में, बाद की कोशिका पीढ़ियों को पारित किया जा सकता है, वितरित आनुवंशिक कार्गो प्रत्येक कोशिका विभाजन के साथ उत्तरोत्तर पतला हो जाएगा। इसलिए, इस प्रकार का आनुवंशिक संशोधन आमतौर पर अस्थायी और स्थानिक रूप से प्रतिबंधित होता है। क्षणिक आनुवंशिक संशोधन मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स में एडेनो से जुड़े वायरस द्वारा या इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, फिशर एट अल.17, किरूसी एट अल.19, और टेरियापिरोम एट अल.20 द्वारा समीक्षा की गई), बाद में इस लेख में विस्तार से वर्णित किया गया है। स्थिर आनुवंशिक संशोधन के विपरीत, यह दृष्टिकोण बहुत तेज और लागत कुशल है। दरअसल, इलेक्ट्रोपोरेशन मिनटों के भीतर किया जा सकता है, और, लक्ष्य सेल आबादी (ओं) के आधार पर, इलेक्ट्रोपोरेटेड ऑर्गेनोइड ्स दिनों के भीतर विश्लेषण के लिए तैयार होते हैं (उदाहरण के लिए, फिशर एट अल.17 और किरोसी एट अल.19 द्वारा समीक्षा की गई)। हालांकि, मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड के सकल रूपात्मक परिवर्तन, जैसे कि आकार में अंतर, इस विधि का उपयोग करके पता नहीं लगाया जा सकता है, क्योंकि इस प्रकार का आनुवंशिक संशोधन अस्थायी और स्थानिक रूप से प्रतिबंधित है। यह प्रतिबंध एक फायदा भी हो सकता है, उदाहरण के लिए, ऑर्गेनॉइड के भीतर व्यक्तिगत कोशिका आबादी का अध्ययन करने या विशिष्ट विकास समय बिंदुओं पर मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स पर प्रभाव (उदाहरण के लिए, फिशर एट अल.17 और किरोसी एट अल.19 द्वारा समीक्षा की गई)।
मस्तिष्क के विकास और विकास के दौरान जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक शास्त्रीय दृष्टिकोण गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में है। गर्भाशय में इलेक्ट्रोपोरेशन कृंतक 21,22,23 और फेरेट24,25 दिमागों में जीन अभिव्यक्ति संरचनाओं के वितरण के लिए एक प्रसिद्ध और उपयोगी तकनीक है। सबसे पहले, रुचि की अभिव्यक्ति निर्माण (ओं) वाले एक समाधान को गर्भाशय की दीवार के माध्यम से भ्रूण के मस्तिष्क के एक निश्चित वेंट्रिकल में माइक्रोइंजेक्ट किया जाता है, जो लक्षित क्षेत्र पर निर्भर करता है। दूसरे चरण में, लक्षित वेंट्रिकल को सीधे अस्तर करने वाली कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए इलेक्ट्रिक पल्स लागू किए जाते हैं। यह दृष्टिकोण न केवल अस्थानिक अभिव्यक्ति या जीन के अतिवृद्धि तक सीमित है, क्योंकि इसे केडी या केओ अध्ययनों में क्रमशःशॉर्ट हेयरपिन (एसएचआरएनए) या सीआरआईएसपीआर / कैस 9 (अभिव्यक्ति प्लास्मिड या राइबोन्यूक्लिओप्रोटीन [आरएनपी] के रूप में) को माइक्रोइंजेक्ट करके भी लागू किया जा सकता है। हालांकि, माउस, चूहे, और फेरेट भ्रूण के गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में वही सीमाएं हैं जो इन पशु मॉडलों के लिए ऊपर वर्णित हैं।
आदर्श रूप से, कोई प्राइमेट्स में सीधे गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में प्रदर्शन करना चाहेगा। हालांकि यह सिद्धांत रूप में, तकनीकी रूप से संभव है, नैतिक चिंताओं, उच्च पशु रखरखाव लागत और छोटे कूड़े के आकार के कारण प्राइमेट्स में गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन आयोजित नहीं किया जाता है। कुछ प्राइमेट्स के लिए, जैसे महान वानर (मनुष्यों सहित), यह बिल्कुल संभव नहीं है। हालांकि, इन प्राइमेट्स में मानव (पैथो) फिजियोलॉजिकल नियोकॉर्टेक्स विकास और इसके विकास के अध्ययन के लिए सबसे बड़ी क्षमता है। इस दुविधा का एक समाधान प्राइमेट ब्रेन ऑर्गेनोइड्स28 के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीक को लागू करना है।
यह पेपर प्राइमेट ब्रेन ऑर्गेनोइड्स, प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स के एक उपप्रकार के इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यह दृष्टिकोण ऑर्गेनोइड्स के वेंट्रिकल जैसी संरचनाओं के भीतर सेल आबादी के तेज और लागत कुशल आनुवंशिक संशोधन की अनुमति देता है। विशेष रूप से, हम मानव (होमो सेपियन्स), चिंपांज़ी (पैन ट्रोग्लोडाइट्स), रीसस मकाक (मकाका मुलाटा), और आम मार्मोसेट (कैलिथ्रेक्स जैकस) आईपीएससी से प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी के लिए एक एकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम माइक्रोइंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीक का विस्तार से वर्णन करते हैं और प्राइमेट सेरेब्रल ऑर्गनॉइड इलेक्ट्रोपोरेशन करने के लिए “गो” और “नो-गो” मानदंड प्रदान करते हैं। यह दृष्टिकोण (पैथो) शारीरिक नियोकॉर्टेक्स विकास और विशेष रूप से मानव स्थिति के करीब एक मॉडल में इसके विकास का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी उपकरण है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रक्रियाएं एक लक्षित इलेक्ट्रोपोरेशन दृष्टिकोण के साथ विभिन्न प्राइमेट प्रजातियों से सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी के लिए एक एकीकृत प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करती हैं। यह एक मॉडल प्?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उन सभी शोधकर्ताओं से माफी मांगते हैं जिनके काम को अंतरिक्ष सीमाओं के कारण उद्धृत नहीं किया जा सका। हम पेट्री डिश इलेक्ट्रोड कक्षों के निर्माण के लिए डीपीजेड में तकनीकी सेवाओं के उलरिच ब्लेयर और एमपीआई-सीबीजी में कार्यशाला के हार्टमुट वुल्फ को धन्यवाद देते हैं; स्टोयन पेटकोव और रुडिगर बेहर मानव (iLonza2.2), रीसस मकाक (iRh33.1) और मार्मोसेट (cj_160419_5) आईपीएससी प्रदान करने के लिए; क्रायोसेक्शनिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के लिए सबरीना हेइड; और पांडुलिपि को आलोचनात्मक रूप से पढ़ने के लिए नेरिंगा लियुटिकेटे और सेसर माटेओ बस्तीदास बेटनकोर्ट। W.B.H. की प्रयोगशाला में काम एक ERA-NET न्यूरॉन (माइक्रोकिन) अनुदान द्वारा समर्थित था। एमएच की प्रयोगशाला में काम एक ईआरसी प्रारंभिक अनुदान (101039421) द्वारा समर्थित था।
Materials
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
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