Таргетная микроинъекция и электропорация церебральных органоидов приматов для генетической модификации
Summary
Электропорация церебральных органоидов приматов обеспечивает точный и эффективный подход к введению переходных генетических модификаций в различные типы предшественников и нейронов в модельной системе, близкой к (пато)физиологическому развитию неокортекса приматов. Это позволяет изучать процессы развития нервной системы и эволюционные процессы, а также может быть применено для моделирования заболеваний.
Abstract
Кора головного мозга является самой внешней структурой мозга и отвечает за обработку сенсорного ввода и моторного выхода; Он рассматривается как место когнитивных способностей более высокого порядка у млекопитающих, в частности, приматов. Изучение функций генов в мозге приматов является сложной задачей по техническим и этическим причинам, но создание технологии органоидов мозга позволило изучить развитие мозга в традиционных моделях приматов (например, макаки-резуса и обыкновенной мартышки), а также у ранее экспериментально недоступных видов приматов (например, человекообразных обезьян) в этически оправданной и менее технически сложной системе. Кроме того, органоиды человеческого мозга позволяют проводить расширенные исследования нервно-психических и неврологических расстройств.
Поскольку органоиды мозга повторяют многие процессы развития мозга, они также представляют собой мощный инструмент для выявления различий и функционального сравнения генетических детерминант, лежащих в основе развития мозга различных видов в эволюционном контексте. Большим преимуществом использования органоидов является возможность введения генетических модификаций, что позволяет тестировать функции генов. Однако внедрение таких модификаций является трудоемким и дорогостоящим. В этой статье описывается быстрый и экономически эффективный подход к генетической модификации клеточных популяций в желудочкоподобных структурах церебральных органоидов приматов, подтипа органоидов мозга. Этот метод сочетает в себе модифицированный протокол для надежной генерации церебральных органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека, шимпанзе, макак-резуса и обыкновенной мартышки с микроинъекционным и электропорационным подходом. Это обеспечивает эффективный инструмент для изучения процессов развития нервной системы и эволюции, который также может быть применен для моделирования заболеваний.
Introduction
Исследование (пато)физиологического развития и эволюции коры головного мозга является сложной задачей, которая затрудняется отсутствием подходящих модельных систем. Ранее такие исследования ограничивались двумерными моделями клеточных культур (таких как первичный нейронный предшественник или культуры нейрональных клеток) и эволюционно удаленными моделями животных (таких как грызуны)1,2. Хотя эти модели полезны для решения определенных вопросов, они ограничены в моделировании сложности, состава типа клеток, клеточной архитектуры и паттернов экспрессии генов развивающегося неокортекса человека в здоровом и болезненном состояниях. Эти ограничения приводят, например, к плохой переводимости мышиных моделей заболеваний человека на ситуацию человека, как описано для некоторых случаев микроцефалии (например, Zhang et al.3). В последнее время трансгенные нечеловекообразные приматы, которые являются эволюционно, функционально и морфологически более близкой моделью развития неокортекса человека, оказались в центре внимания 4,5,6,7,8, поскольку они преодолевают многие ограничения моделей, основанных на клеточных культурах и грызунах. Тем не менее, использование нечеловеческих приматов в исследованиях не только очень дорого и отнимает много времени, но и вызывает этические проблемы. Совсем недавно развитие технологии органоидов мозга 9,10 стало многообещающей альтернативой, которая решает многие ограничения предыдущих моделей 11,12,13,14,15,16.
Органоиды мозга представляют собой трехмерные (3D) многоклеточные структуры, которые имитируют основные особенности цитоархитектинации и клеточного состава одной или нескольких областей мозга для определенного временного окна развития 11,12,13,14,17. Эти 3D-структуры генерируются либо из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), либо, если они доступны для интересующих видов, из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). В целом, на основе используемой методологии можно выделить два типа органоидов мозга: неуправляемые и регионализованные (управляемые) органоиды мозга18. При создании последнего типа органоидов предусмотрены небольшие молекулы или факторы, которые направляют дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в органоиды определенной области мозга (например, органоиды переднего мозга)18. Напротив, в неуправляемых органоидах дифференциация не определяется добавлением малых молекул, а скорее опирается исключительно на спонтанную дифференцировку ИПСК/ЭСК. Полученные органоиды мозга состоят из типов клеток, представляющих различные области мозга (например, церебральные органоиды)18. Органоиды мозга сочетают в себе многие ключевые особенности развития мозга с относительно экономичной и эффективной по времени генерацией из любых видов, представляющих интерес, для которых доступны ИПСК или ЭСК11,12,13,14. Это делает органоиды мозга отличной моделью для многих видов нейробиологических исследований, начиная от вопросов эволюции и развития и заканчивая моделированием заболеваний и тестированием лекарств15,16. Однако решение таких вопросов с помощью органоидов мозга сильно зависит от наличия различных методов генетической модификации.
Одним из ключевых аспектов изучения неокортекса (пато)физиологического развития и его эволюции является функциональный анализ генов и вариантов генов. Обычно это достигается путем (эктопической) экспрессии и/или нокдауна (KD) или нокаута (KO) этих генов. Такие генетические модификации могут быть классифицированы как стабильные и преходящие генетические модификации, а также модификации, ограниченные или не ограниченные во времени и пространстве. Стабильная генетическая модификация определяется введением генетического изменения в геном хозяина, которое передается всем последующим поколениям клеток. В зависимости от момента генетической модификации он может влиять на все клетки органоида или может быть ограничен определенными клеточными популяциями. Чаще всего стабильная генетическая модификация достигается в органоидах мозга на уровне iPSC/ESC путем применения лентивирусов, транспозоноподобных систем и технологии CRISPR/Cas9 (рассмотрено, например, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 и Teriyapirom et al.20). Это имеет то преимущество, что все клетки органоида мозга несут генетическую модификацию и что она не ограничена ни во времени, ни в пространстве. Однако генерация и характеристика этих стабильных линий iPSC/ESC занимает очень много времени, часто занимая несколько месяцев, прежде чем можно будет проанализировать первые модифицированные органоиды мозга (рассмотренные, например, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 или Teriyapirom et al.20).
Напротив, преходящая генетическая модификация определяется доставкой генетического груза (например, плазмиды экспрессии генов), которая не интегрируется в геном хозяина. Хотя эта модификация в принципе может быть передана последующим поколениям клеток, доставленный генетический груз будет постепенно разбавляться с каждым делением клетки. Поэтому этот тип генетической модификации обычно ограничен во времени и пространстве. Преходящая генетическая модификация может осуществляться в органоидах мозга аденоассоциированными вирусами или электропорацией (рассмотрено, например, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 и Teriyapirom et al.20), причем последнее подробно описано в этой статье. В отличие от стабильной генетической модификации, этот подход очень быстрый и экономически эффективный. Действительно, электропорация может быть выполнена в течение нескольких минут, и, в зависимости от популяции клеток-мишеней, электропорированные органоиды готовы к анализу в течение нескольких дней (рассмотрено, например, Fischer et al.17 и Kyrousi et al.19). Однако грубые морфологические изменения органоида мозга, такие как различия в размерах, не могут быть обнаружены с помощью этого метода, поскольку этот тип генетической модификации ограничен во времени и пространстве. Это ограничение также может быть преимуществом, например, в случае изучения отдельных клеточных популяций внутри органоида или воздействия на органоиды мозга в определенные моменты времени развития (рассмотрено, например, Fischer et al.17 и Kyrousi et al.19).
Классический подход к изучению функции генов во время развития и эволюции мозга заключается в внутриутробной электропорации. Внутриутробная электропорация является хорошо известным и полезным методом доставки конструкций экспрессии генов в мозг грызунов 21,22,23 и хорька 24,25. Во-первых, раствор, содержащий интересующую конструкцию (конструкции) экспрессии, микроинъецируют через стенку матки в определенный желудочек эмбрионального мозга, в зависимости от области, на которую будет нацелена. На втором этапе электрические импульсы применяются для трансфицирования клеток, непосредственно выстилающих целевой желудочек. Этот подход не ограничивается только эктопической экспрессией или сверхэкспрессией генов, поскольку он также может быть применен в исследованиях KD или KO путем микроинъекции короткой шпильки (шРНК) или CRISPR/Cas9 (в виде экспрессионных плазмид или рибонуклеопротеинов [RNP]) соответственно26,27. Однако внутриутробная электропорация эмбрионов мышей, крыс и хорьков имеет те же ограничения, что и описанные выше для этих животных моделей.
В идеале хотелось бы проводить внутриутробную электропорацию непосредственно у приматов. Хотя это, в принципе, технически возможно, внутриутробно электропорация у приматов не проводится из-за этических соображений, высоких затрат на содержание животных и небольших размеров помета. Для некоторых приматов, таких как человекообразные обезьяны (включая людей), это вообще невозможно. Однако эти приматы обладают наибольшим потенциалом для изучения (пато)физиологического развития неокортекса человека и его эволюции. Одним из решений этой дилеммы является применение метода электропорации к органоидам мозга приматов28.
В данной работе представлен протокол электропорации подтипа органоидов мозга приматов, церебральных органоидов приматов. Этот подход позволяет быстро и экономически эффективно генетическую модификацию клеточных популяций в желудочкоподобных структурах органоидов. В частности, мы описываем унифицированный протокол генерации церебральных органоидов приматов из ИПСК человека (Homo sapiens), шимпанзе (Pan troglodytes), макак-резуса (Macaca mulatta) и обыкновенной мартышки (Callithrix jacchus). Кроме того, мы подробно описываем технику микроинъекций и электропорации и предоставляем критерии «идти» и «нет» для выполнения электропорации органоидов головного мозга приматов. Этот подход является эффективным инструментом для изучения (пато)физиологического развития неокортекса и его эволюции в модели, особенно близкой к человеческой ситуации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанные здесь процедуры представляют собой унифицированный протокол генерации церебральных органоидов от разных видов приматов с целевым электропорационным подходом. Это позволяет эктопическую экспрессию ГОИ в модельной системе, которая имитирует (в том числе человека) (пато)физи…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы приносим извинения всем исследователям, чьи работы не могли быть процитированы из-за нехватки места. Мы благодарим Ульриха Блейера (Ulrich Bleyer) из технической службы DPZ и Хартмута Вольфа (Hartmut Wolf) из цеха MPI-CBG за строительство электродных камер чашки Петри; Стоян Петков (Stoyan Petkov) и Рюдигер Бер (Rüdiger Behr) за обеспечение ИПСК человека (iLonza2.2), макак-резуса (iRh33.1) и мартышек (cj_160419_5); Сабрина Хайде для криосекции и иммунофлуоресцентного окрашивания; а также Неринге Лютикайте и Сезару Матео Бастидасу Бетанкуру за критическое прочтение рукописи. Работа в лаборатории W.B.H. была поддержана грантом ERA-NET NEURON (MicroKin). Работа в лаборатории М.Х. была поддержана стартовым грантом ERC (101039421).
Materials
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
Referências
- Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
- Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).
- Zhang, W., et al. Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2612 (2019).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Niu, Y., et al. Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Shi, L., et al. Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development. National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).
- Heide, M., et al. Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset. Science. 369 (6503), 546-550 (2020).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem cell models of human brain development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Arlotta, P. Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease. Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).
- Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution. Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
- Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases. Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30 (2021).
- Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 558 (2019).
- Pașca, S. P., et al. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).
- Kyrousi, C., Cappello, S. Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347 (2020).
- Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -. K. Genetic engineering in organoids. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 555-568 (2021).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia do Desenvolvimento. 240 (1), 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociência. 103 (4), 865-872 (2001).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5 (1), 24 (2012).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Fischer, J., et al. Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Reports. 23 (11), e54728 (2022).
- Stauske, M., et al. Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions. Cells. 9 (6), 1349 (2020).
- Mora-Bermúdez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. eLife. 5, e18683 (2016).
- Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules. Cells. 9 (11), 2422 (2020).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), dev166884 (2019).
- Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protocols. 3 (1), 101129 (2022).
- Denoth-Lippuner, A., et al. Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT. Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).
- Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids. Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).
